突破性双价疫苗：一次接种，同时抵御两种致命疟原虫

摘要：疟疾作为全球重大传染病，每年威胁着数十亿人的健康，其中恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和间日疟原虫（Plasmodium vivax）是最主要的致病种类。由于这两种疟原虫常在同一地区流行，且间日疟原虫具有独特的休眠子导致复发的特性，传统单靶点疫苗难以有效控制疟疾传播。本文详细介绍了一种新型双价病毒载体疫苗的研发成果，该疫苗通过融合痘苗病毒 LC16m8Δ（m8Δ）和腺相关病毒 1 型（AAV1）作为载体，同时表达针对两种疟原虫的关键抗原，在动物实验中实现了 70% 的感染保护率和 90% 的传播阻断效果，且免疫应答可持续 7 个月以上。这项研究为疟疾的防控和消除提供了突破性解决方案，尤其在两种疟原虫共存的地区具有重要应用价值。一、疟疾防控的严峻现状与挑战1.1 全球疟疾的沉重负担

疟疾是由疟原虫属寄生虫引起、通过雌性按蚊传播的传染病，至今仍是全球热带和亚热带地区的主要公共卫生威胁。根据世界卫生组织数据，2023 年全球有 83 个国家约 27 亿人受到疟疾影响，43% 的世界人口处于感染风险中，全年因疟疾死亡的人数近 59.7 万，其中撒哈拉以南非洲的儿童是最主要的受害者。

恶性疟原虫和间日疟原虫是临床意义最重大的两种疟原虫。恶性疟原虫因在撒哈拉以南非洲导致高死亡率而成为研究重点，但间日疟原虫的影响范围更广，波及 95 个国家，每年威胁 28.5 亿人。更复杂的是，在两种疟原虫共同流行的地区，混合感染频发，给诊断、治疗和防控带来巨大挑战。

1.2 间日疟原虫的独特威胁

间日疟原虫的防控难度远超恶性疟原虫，其关键原因在于它能形成休眠子—— 一种潜伏在肝脏中的休眠阶段。当休眠子被重新激活时，即使没有新的蚊虫叮咬，也会导致疟疾复发。这种特性不仅增加了疾病负担，还延长了传播链，成为疟疾消除的主要障碍。传统疫苗和治疗方法对休眠子无效，因此开发能提供长期保护以阻断复发的疫苗至关重要。

1.3 现有疫苗的局限性

目前已有的疟疾疫苗存在明显短板。例如，RTS,S 疫苗在 III 期临床试验中的保护 efficacy 仅约 31%；新一代的 R21 疫苗虽在布基纳法索的儿童中实现了 24 个月内 77% 的保护率，但两者都仅针对恶性疟原虫。针对间日疟原虫的疫苗（如 Rv21）虽能在小鼠中诱导持久保护，但仍需优化以覆盖不同菌株（如 VK210、VK247）。世界卫生组织在《2030 年疟疾疫苗技术路线图》中明确提出，急需一种对两种疟原虫均有至少 75% 保护率、且能阻断传播的多阶段疫苗。

二、双价疟疾疫苗的设计与创新2.1 疫苗平台的突破性选择

研究团队基于前期开发的单价疫苗技术，构建了一种新型双价疫苗平台，融合了两种病毒载体的优势：

• 高度减毒的痘苗病毒 LC16m8Δ（m8Δ）：作为初始免疫（prime）载体，具有良好的免疫原性和安全性。

• 腺相关病毒 1 型（AAV1）：作为加强免疫（boost）载体，能诱导持久的免疫应答。

这种 “m8Δ 初始 - AAV1 加强” 的异源免疫策略，可同时表达两种疟原虫的多阶段抗原，实现抗感染和阻断传播的双重功能。

2.2 关键抗原的选择与融合设计

疫苗的核心是表达四种关键抗原的融合蛋白：

• 恶性疟原虫的环子孢子蛋白（PfCSP）和子孢子表面蛋白（Pfs25）

• 间日疟原虫的环子孢子蛋白（PvCSP，涵盖 VK210 和 VK247 菌株）和子孢子表面蛋白（Pvs25）

其中，Pfs25 和 Pvs25 是阻断传播的关键抗原（针对疟原虫在蚊虫体内的发育阶段），而 PfCSP 和 PvCSP 则负责预防感染（针对疟原虫进入人体后的肝脏阶段）。通过铰链肽（Gly₆Ser₁）连接这些抗原，确保了蛋白的稳定性和免疫原性（图 1）。

图 1 重组双价疫苗的构建。（a）m8Δ-Pf (s25-CSP) 单价疫苗；（b）m8Δ-Pv (s25-CSP) 单价疫苗；（c）m8Δ-Pf/Pv (s25-CSP) 双价疫苗；（d）AAV1-Pf (s25-CSP) 和 AAV1-Pv (s25-CSP) 单价疫苗。

2.3 疫苗的生产与验证

在 HEK293T 细胞中，m8Δ 和 AAV1 载体成功表达了融合蛋白，通过免疫印迹和免疫荧光实验验证，这些蛋白能与特异性单克隆抗体结合，分子量约为 80-100 kDa，且正确定位于细胞表面（补充图 1），证明了疫苗的有效性。

三、双价疫苗的免疫应答与长期保护效果3.1 强大且持久的抗体反应

研究团队将小鼠分为三组进行免疫：

1. 双价疫苗组：m8Δ-Pf/Pv 初始免疫 + AAV1-Pf+AAV1-Pv 加强免疫

2. 混合疫苗组：m8Δ-Pf + m8Δ-Pv 初始免疫 + AAV1-Pf+AAV1-Pv 加强免疫

3. 单价疫苗组：分别针对两种疟原虫的单价疫苗免疫（表 1）

表 1 疫苗组及免疫方案。展示了单价、双价和混合疫苗的初始免疫和加强免疫所用载体及剂量。

结果显示，双价疫苗诱导了针对四种抗原的高滴度抗体，且在免疫后8 个月内持续维持（图 3）。尽管双价疫苗的抗 CSP 抗体滴度低于单价和混合疫苗组（图 2a-c），但其保护效果更优，提示免疫应答的质量（如针对关键表位）可能比数量更重要。

图 2 抗体滴度评估。（a-d）分别为针对 PfCSP、Pfs25、PvCSP-VK210、Pvs25 的抗体滴度；（e）针对 PvCSP-VK247 的抗体滴度（未检测到）。

图 3 长期抗体滴度评估。双价疫苗免疫后 224 天内，针对 PfCSP（a）、Pfs25（b）、PvCSP-VK210（c）、Pvs25（d）的抗体滴度变化。

3.2 抗体应答的特异性分析

对恶性疟原虫 PfCSP 的 N 端、重复区和 C 端的抗体反应分析发现：

• 单价疫苗组中，47.54% 的抗体针对重复区，47.14% 针对 C 端；

• 双价和混合疫苗组中，C 端的抗体占比显著提高（分别为 79.13% 和 84.13%），重复区占比下降（图 4）。

这表明双价疫苗使抗体应答更集中于C 端区域，而该区域可能与保护作用密切相关。

3.3 针对转基因疟原虫的保护效力

在小鼠实验中，双价疫苗对表达 PfCSP 或 PvCSP-VK210 的转基因伯氏疟原虫（P. berghei）的保护率均达到70%（图 4a,c），远高于混合疫苗组（40%-50%）。在 28 天后的再次挑战中，双价疫苗组仍有 66.7%（针对间日疟原虫）和 42.9%（针对恶性疟原虫）的保护率（图 4b,d），证明其持续保护能力。

图 4 对孢子体挑战的保护效力。（a）首次挑战 PfCSP/Pb 的结果；（b）首次存活小鼠再次挑战 PvCSP-VK210/Pb 的结果；（c）首次挑战 PvCSP-VK210/Pb 的结果；（d）首次存活小鼠再次挑战 PfCSP/Pb 的结果。

四、阻断疟疾传播的关键能力4.1 对恶性疟原虫的传播阻断效果

通过直接饲喂实验（DFA）评估发现，接种双价疫苗的小鼠血液使蚊虫中肠的卵囊数量减少 85%（传播减少活性 TRA=85%），感染蚊虫的比例从 91.8% 降至 62.2%（传播阻断活性 TBA=32%）（图 5），证明其能有效阻断恶性疟原虫在蚊虫中的发育。

图 5 双价疫苗对恶性疟原虫的传播阻断效果（DFA 实验）。展示了免疫小鼠与对照小鼠血液饲喂蚊虫后的卵囊数量差异。

4.2 对间日疟原虫临床分离株的传播阻断效果

使用巴西亚马逊地区患者的间日疟原虫分离株进行膜饲喂实验（DMFA），结果更为显著：

• 短期（免疫后 28 天）：1:5 血清稀释时，TRA 达 99.08%，TBA 达 87.52%，且对遗传多样性的分离株均有效（图 6、表 2）；

• 长期（免疫后 232 天）：1:5 血清稀释时，TRA 仍达 89%，TBA 达 67.34%（图 7），证明疫苗的持久传播阻断能力。

图 6 双价疫苗对间日疟原虫的短期传播阻断效果（DMFA 实验）。展示了不同血清稀释度下的卵囊数量差异。

表 2 DMFA 实验中的 TRA（传播减少活性）和 TBA（传播阻断活性）数据。展示了短期和长期免疫血清在不同稀释度下的效果。

图 7 双价疫苗对间日疟原虫的长期传播阻断效果（DMFA 实验）。免疫后 232 天的血清仍能显著减少卵囊数量。

五、双价疫苗的优势与应用前景5.1 与现有疫苗的比较优势

• 双重保护：同时针对恶性疟原虫和间日疟原虫，解决混合感染问题；

• 多阶段作用：既阻断感染（CSP 抗原），又阻断传播（s25 抗原），形成防控闭环；

• 持久效力：免疫应答持续 7 个月以上，满足季节性传播地区的防控需求；

• 成本效益：双价疫苗比混合使用两种单价疫苗更经济，且生产流程更简单。

尽管成果显著，仍需解决以下问题：

• VK247 菌株的覆盖：目前未检测到针对 PvCSP-VK247 的抗体，需优化抗原设计；

• 免疫干扰：需进一步研究双价疫苗中抗原间是否存在免疫竞争，可通过调整剂量或添加佐剂缓解；

• 临床转化：已在非人灵长类动物中启动安全性和效力评估，下一步将推进 I 期临床试验。

世界卫生组织指出，疟疾消除需要 “全方位策略”，包括 vector control、诊断、治疗和疫苗。这种双价疫苗通过同时降低感染率和传播率，能与其他措施形成协同效应，尤其在东南亚、南美洲等两种疟原虫共存的地区，可能加速疟疾消除进程。

结语

这款双价病毒载体疫苗的研发是疟疾防控领域的重大突破，其 70% 的保护率和 90% 的传播阻断率，以及长达 8 个月的免疫持久性，使其成为应对恶性疟原虫和间日疟原虫共同威胁的理想候选疫苗。随着临床研究的推进，有望为全球疟疾消除事业提供关键工具，最终减轻数十亿人的疾病负担。

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