糖基化对单克隆抗体构象和稳定性的影响

摘要：抗体糖基化是一种常见的翻译后修饰，对于抗体的效应功能具有关键作用。使用糖工程技术来生产具有特定糖异构体的抗体可能是实现所需治疗效果所必需的。然而，由于内在特性和稳定性的改变，修饰后的分子在开发过程中可能表现出不同寻常的行为。本文关注糖基化抗体和去糖基化抗体之间的差异，因为在不需要或不重要的情况下，通常会选择无糖基抗体。在此选择了三种人类 IgG1 抗体，并使用 PNGase F 去除其寡糖链。尽管去糖基化后没有检测到二级或三级结构的变化，但在去除 Fc 区域的寡糖链后，抗体的其他内在特性发生了改变。根据尺寸排除色谱分析，去糖基化后的表观分子水合半径增加。去糖基化抗体的 CH2 结构域的热稳定性较差，对 GdnHCl 诱导的展开表现出较低的抵抗力。对蛋白酶裂解的敏感性表明，去糖基化类型对木瓜蛋白酶的敏感性更高。一项加速稳定性研究显示，去糖基化抗体的聚集速率更高。这些变化可能影响无糖基抗体生物治疗药物的开发。

【NO.1】介绍

单克隆抗体（mAb）具有高选择性和特异性，在生物治疗药物市场中占很大一部分且不断增长。大多数市售mAb都属于IgG类。IgG，由两条重链和两条轻链组成，由总共16个分子间或分子内二硫键连接。两条重链通过二硫键连接，每条重链都与轻链二硫键合。IgG包括抗原结合（Fab）和可结晶（Fc）区域：Fab负责与抗原结合，而Fc与Fcγ受体结合，后者调节免疫反应。

在从候选药物到上市产品的mAb开发过程中，经常会出现稳定性问题，例如由于物理不稳定而导致的聚集，或由于化学不稳定而导致的脱酰胺或氧化。解决稳定性问题需要大量的资源和时间；因此，这个领域是一个备受关注的领域。也可能影响mAb稳定性的一个因素是在Fc区域中发现的糖基化。糖基化是哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢（CHO）细胞）产生的IgG抗体的常见翻译后修饰，经常用于生产。IgG1分子在Asn处包含一个N-连接聚糖在两条重链中。在N-糖的合成过程中，可以添加多个糖基团以形成不同的糖型，例如G0、G1、G2，无果糖基化复合物。糖基化通过调节与Fcγ受体的结合，对补体依赖性细胞毒性（CDC）和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）功能起重要作用。可能需要特定的糖型才能达到治疗效果。这些糖型可能以糖基化工程为靶标，但也可能受到细胞培养条件的影响。

本文重点介绍了去糖基化抗体。产品糖基化模式的变化可能会显著改变其固有特性和稳定性。从而增加了下游工艺开发的挑战。因此，在工艺开发过程中，充分了解糖基化对蛋白质特性的影响是有用的。本文通过研究三种IgG1 mAb，系统地评估了糖基化对分子结构和稳定性的影响，这些mAb对Asn上包含一个N-连接糖基化位点重链。在使用PNGaseF从抗体中体外去除寡糖链后，在此使用生物物理技术和生化方法比较了糖基化和去糖基化形式的内在分子特性。还进行了加速稳定性测试，以评估对保质期稳定性的潜在影响。

【NO.2】结果

2.1 PNGaseF消化

为了生成用于研究的去糖基化抗体，使用PNGaseF在体外去除N-糖。PNGaseF消化和色谱纯化后，通过液相色谱-质谱（LC-MS）获得重链的还原质量数据。光谱来自多电荷离子，并使用AnalystQS2.0/BioAnalyst2.0软件包进行反卷积。观察到的每种抗体的重链糖型分子量对应于预测质量数（表1)。获得的去糖基化抗体重链的质量证实了寡糖链的切割。

表1.还原条件下mAb重链的质量

2.2二级和三级结构测定

在PNGaseF处理后，对抗体的高阶结构进行光谱评估以验证结构完整性。傅里叶变换红外（FTIR）光谱用于评估二级结构。图1显示了两种形式的mAb1-3的酰胺I条带的二阶导数谱图的叠加图。结果表明，体外去糖基化后的次级结构变化不显著。此外，mAb1、mAb2和mAb3之间没有显著的二级结构差异，这可能是因为所有三种抗体共享相同的框架，并且它们的主要结构是β折叠。

图1.FTIR酰胺I谱带的二阶导数光谱叠加

还收集了内在荧光数据以检测抗体样品三级结构的总体变化。激发波长为295nm时，糖基化和去糖基化mAb1在336nm处均具有发射峰（图2A)；糖基化和去糖基化mAb2在341nm处均具有发射峰（图2B)；糖基化和去糖基化mAb3在343nm处均具有发射峰（图2C)。每种抗体的糖基化和去糖基化种类的荧光光谱没有显着差异的事实表明，在PNGaseF消化后，Trp残基周围的微环境不会受到实质性干扰。mAb1、mAb2和mAb3之间发射峰波长的差异可能是由于Fab区互补决定区（CDR）序列中的Trp组成不同。

图2.来自本征荧光光谱的三级结构分析

2.3体积排阻色谱分析

在评估了高阶结构后，我们使用SEC表征了去糖基化后抗体的聚集体和片段水平。抗体的SEC图谱的扩展视图如图3A–C.在PNGaseF消化过程中，在37°C下孵育24小时后，每种抗体的SEC谱保持不变。聚集体或片段物种没有显著增加（表2)。然而，去糖基化抗体的单体种类的洗脱时间发生了变化：mAb1、mAb2和mAb3在糖基释放后在SEC中洗脱较早（图3A–C)。该结果表明，去除寡糖可能导致流体动力学半径增加，但需要注意的是，抗体与色谱柱填料表面的相互作用没有变化。

表2.SEC分析中mAb的分子量大小分布

图3.糖基化和糖基释放mAb的体积排阻色谱分析

2.4热稳定性评估

热稳定性是药物开发过程中可能很重要的另一个内在特性。在此使用差示扫描量热法（DSC）来评估糖基化和去糖基化抗体（图4A–C)。先前的研究表明，抗体在DSC中通常具有三个热转变。在图4A具有最低转变温度的第一个峰表示CH的热转变mAb1的Fc区的结构域；峰高最大的第二个峰代表mAb1的Fab区的热转变；具有最高转变温度的第三个峰是CH的贡献mAb1的Fc区的结构域。有时是Fab区域和CH的热转变域非常接近，因此热谱图中的最后两个峰合并为一个峰，例如mAb2（图4B)。去糖基化后，Fab区和CH没有明显的热转变变化区域的3mAb的3个mAb的图4A–C。然而，CH的转变温度与糖基化形式相比，去糖基化后的结构域低约6∼8°C。图4A–C显示所有三个热谱图在CH中都有相似的过渡偏移域。这一结果表明，寡糖链的存在稳定了CH2结构域，对其他mAb区域的影响最小，这证实了Mimura等人之前的研究结果。稳定性可能来自两条寡糖链或寡糖链与CH之间的相互作用域。

图4.通过差示扫描量热法监测mAb的热诱导去折叠

2.5胍HCl诱导变性

紫外光谱用于监测胍·盐酸（GdnHCl）。收集吸光度光谱（图5A），计算每个谱的二阶导数（图5B)。在本研究中，292nm附近的负峰（由图5B）选择来自二阶衍生物UV作为标记物来监测Trp残基微环境的变化。GdnHCl诱导的糖基化和去糖基化mAb1的去折叠表现为图5C。mAb2的去折叠如图5DmAb3的去折叠如图5E。展开过程中结构转变的中点总结如下表3。所有三种抗体都显示出相似的趋势：去糖基化形式对GdnHCl诱导的去折叠的抵抗力较低（转变的中点出现在GdnHCl浓度低约0.6M时）。这一展开结果与本报告中的DSC数据一致，该数据表明抗体Fc区的糖基赋予分子稳定性。

表3.GdnHCl诱导的mAb去折叠

图5.通过二阶导数紫外吸光度光谱监测MAb去折叠

2.6木瓜蛋白酶消化

以前的研究表明糖基化模式会影响抗体对木瓜蛋白酶消化的抵抗力。因此，本文使用木瓜蛋白酶作为探针来评估去除寡糖后抗体对蛋白水解裂解的敏感性。SEC用于将完整mAb与酶解物质分离。单体含量与消化时间的关系图图6。数据显示，所有三种抗体在糖基释放后都更容易受到木瓜蛋白酶消化的影响，三种糖基化抗体或三种糖基释放抗体之间几乎没有观察到差异。

图6.木瓜蛋白酶消化后抗体的单体量与消化时间的关系

2.7加速稳定性

本文还评估了糖基化和糖基释放抗体在加速条件下长达三个月的稳定性。在本研究中，SEC被用作主要的稳定性指示测定方法。SEC色谱图中聚集体、片段和单体的百分比分别绘制在图7A–C。图7A显示所有三种抗体在去糖基化后都表现出更高的聚集率。尽管本研究中抗体的聚集体形成速率增加相对适度，但其他无糖基抗体的聚集速率可显著增加（数据未显示）。图7B显示去糖基化后没有显着的碎裂速率变化。因此，抗体的单体形式的降解率较高图7C主要是由于去糖基化后聚集速率的增加。这项研究表明，去除寡糖链会对抗体的保质期稳定性产生不利影响。

图7.稳定性样品的体积排阻色谱分析

【NO.3】讨论

本研究中观察到在SEC中，糖基释放的mAb的单体形式比糖基化mAb更早洗脱。这是由于糖基释放后抗体的流体动力学半径增加，或者是糖基释放抗体与柱填料之间的非特异性相互作用减少。为了排除后一种解释，研究重复了含有10%异丙醇的流动相的SEC实验，这可以减少抗体与填料骨架之间的疏水相互作用；或使用Superdex200而不是TSKG3000SWXL色谱柱，它具有不同的树脂骨架。SEC流动相改性和色谱柱填料更换的结果（数据未显示）与我们之前的研究结果一致图3A–C，即糖基化抗体的单体比糖基化抗体的单体洗脱得早。因此，去糖基化后抗体单体在SEC中保留时间的减少很可能是由于流体动力学半径的变化。

计算建模是揭示与抗体溶液相结构和动力学相关的现象的机理基础的一种潜在方法。目前正在进行的一项此类研究表明，去糖基化允许CH2-CH2Fc区的结构域，以呈现这两个结构域比相应的糖基化结构相距更远的构象。这种现象可能是SEC检测到的糖基释放抗体的流体动力学体积略大的原因。

在此使用了三种IgG1 mAb，它们基于包含重链V的人框架HIII和轻链VκI对序列进行亚组，但在Fab区域使用不同的CDR序列作为本报告中的模型蛋白。之前的一项研究表明，由于自缔合，Fab-Fab相互作用在增加粘度方面起着关键作用。这种Fab-Fab相互作用在聚集体形成过程中也可能很重要，糖基化mAb1、mAb2和mAb3在SEC中表现出不同的聚集水平（表2)。此外，去除游离寡糖（图7A)。因为PNGaseF治疗期间发生的唯一变化是去除CH2结构域聚糖，这一结果表明CH2区域在聚合形成过程中也参与其中。Chennamsetty等人以前研究显示糖基化位点附近有几个易聚集的基序，例如残基Val282、Val282, Pro291, Tyr296, Val308, Leu309在去糖基化后可能会发生局部构象变化。Kayser等人的最新报告还提到被碳水化合物掩盖的疏水残基在去糖基化后暴露出来。两篇报告在分析过程中都使用了分子动力学模拟，并表明CH中的疏水性发生了变化区域在聚集体形成过程中起着重要作用。为了进一步探索这一假设，我们使用SYPRO Orange染料作为探针评估了去糖基化后的疏水性变化。SYPRO Orange染料具有高选择性和灵敏度，可与蛋白质的疏水区域相互作用，并产生易于测量的强荧光信号。图8A–C表明，所有三种抗体在去糖基化后外源性荧光强度均增加，这表明去除寡糖后疏水区域增加。最重要的是，Fab地区和CH的CDR2Fc区的结构域参与聚集体的形成，而不太稳定的CH2去糖基化后的结构域对高温下聚集速率的增加有很大贡献。

图8.使用SYPROOrange染料对糖基化和去糖基化mAb进行荧光测量

另一方面，尽管CDR序列和CH的去糖基化结构域对抗体聚集（图7A），碎裂率（图7B）在任何糖基化或糖基化分子的加速稳定性研究过程中。结果可能是由于这些抗体共享相同的框架并且仅在CDR中不同，而片段化是铰链区域内的分子内自切割反应。先前的研究表明，序列SCDKTHTC促进铰链区肽键的裂解。可能的切割位点包括S/C、C/D、D/K和H/T。因此，去糖基化或CDR序列的变化对SCDKTHTC序列的结构没有影响。然而，当木瓜蛋白酶用于蛋白酶消化研究时，去糖基化抗体的降解速率增加（图6），即所有三种抗体在去糖基化后都更容易受到蛋白酶消化的影响，这与以前的报道一致。因此，从IgG1抗体亚型中去除寡糖可能对CH产生局部构象影响结构域，并增加蛋白酶对铰链区域的可及性。这种构象变化是局部的在去糖基化（图1和2)。其他研究人员还报告说，游离寡糖链的去除会影响抗体从蛋白A和蛋白G色谱中洗脱，这可能是由低pH值下的局部构象变化引起的。

He等人最近的一项研究表明：与其他糖基化IgG1或IgG相比，去糖基化IgG1分子的稳定性明显较低，这与DSC的结果相似（图4A–C）和GdnHCl诱导的去折叠（图5C–E）实验。我们的研究对抗体药物开发的一个潜在影响是，由于稳定性降低，无糖基抗体的开发可能会出现不可预见的挑战。总之，当前研究中的数据表明，IgG1中的N-连接寡糖对结构稳定性做出了重要贡献，这在生物治疗药物开发过程中可能具有重要意义。

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