Nature Methods丨陈知行团队发明新一代高亮度高光稳定性罗丹明活细胞荧光探针

近年来，在生物成像领域涌现了一批新兴的高/超分辨显微技术，结合仪器和算法的创新，实现了对细胞生理活动的3D长时程动态全景记录，从而为生物医学相关学科的发展提供了颠覆性工具。这些进展同时也对新时代的荧光探针技术提出了更高的要求。可以说，开发更亮更稳定更高生物相容性的新一代活细胞荧光探针，将决定成像技术的性能极限，成为精确可视化细胞的时空动态和信号调节的基础设施。

然而，以JF系列为代表的现有的化学荧光探针的光稳定性和生物相容性的优化并不理想。能否通过光物理化学原理创新，开发同时具备高亮度、高光稳定性和优异的生物相容性的“全能型”荧光团，在多个重要核心参数上建立全面的优势，是本领域亟待解决的技术难题。

2025年5月19日，北京大学未来技术学院陈知行团队在Nature Methods杂志发表了题为A Palette of Bridged Bicycle-Strengthened Fluorophores的研究文章，提出了以氧或砜取代氮杂[3.2.1]桥环为助色团创制高性能荧光探针的集成化、模块化通用设计策略，构建了一系列光谱横跨紫外和可见光范围的BD（Bridged Dye）系列高性能生物相容性染料，并与HaloTag蛋白质标签技术结合实现了不同尺度生物体内特定蛋白的标记及长时程/三维超分辨成像。BD染料拥有优异的亮度及出色的光稳定性，且彻底抵抗光谱蓝移造成的伪影，在单分子成像、固定或活哺乳动物细胞和植物细胞的超分辨率成像（STED和SIM），以及斑马鱼在体成像和基于化学遗传学的电压成像实验中都有良好表现，展现出显著优于已报道JF Fluor、ATTO dye、SiR等先进染料的光子预算及成像时长。

作者从化学原理出发，基于 助色团分子工程 ， 综合运用位阻效应、电子效应、Bredt规则、氢键受体调节等策略，结合计算化学等辅助预测手段， 设计了新型 砜或氧取代氮杂[3.2.1]桥环助色团 结构（图1a），将其应用于罗丹明、香豆素、噁嗪等多种荧光母体中（图1b）并对其各项光物理性质进行了详细表征。该助色团有独特的杂原子取代桥联双环体系，通过减小位阻和吸电子诱导，双管齐下抑制扭曲分子内电荷转移（TICT）态的形成，最大程度提升探针亮度（荧光量子产率至高可达0.98）。需要特别指出的是，该桥环独特的化学结构可以从根本上 彻底抑制助色团光氧化脱烷基所带来的光谱蓝移现象， 实现探针光稳定性的大幅跃升83%-819%（图1c），这对获得更多光子预算、减少多色成像中产生的光谱串扰伪影，及避免荧光探针与蛋白之间的非特异性交联至关重要。

图1 Bridge Dye设计思路、化学结构及光稳定性表征。

BD系列荧光探针不仅具有出色的光学性质，还具有优异的生物相容性。两种类型（砜或氧取代）的助色团含有不同数量的氢键受体，这将使染料具有可调节的水溶性和细胞膜渗透性，以适应体外生物大分子偶联或活细胞标记等多种生物应用场景。作者着重测试了了BD荧光探针的HaloTag功能化衍生物（BD566HTL、BD626HTL和BD666HTL）并在多物种中及跨尺度先进成像设备上展示了其优越性能。BD566HTL和BD626HTL染料与HaloTag蛋白标签共价结合后亮度显著高于现有最先进的JF549、SiR等化学荧光染料（提升14%-64%），是mScarlet3-H等同波段先进红色荧光蛋白亮度的4倍左右。BDHTL系列荧光探针光稳定性相比同波段染料最高可提升20倍（以荧光强度衰减一半所用时间计算），从而对活细胞超分辨长时程多维观测实验产生全面提升。例如BDHTL系列染料在3D/长时程超分辨成像中的表现尤为突出：BD626HTL活细胞STED成像线粒体外膜和细胞骨架动态变化观测时长相较于SiRHTL和JF646HTL提升100%-200%；BD626HTL还可以承受超过30帧3D STED图像拍摄从而重构线粒体完整外膜。此外，作者还通过解析BD626HTL与HaloTag蛋白复合物的晶体结构发现了荧光探针助色团与蛋白残基间新的极性相互作用，这将对后续基于BD荧光探针开发混合型传感器具有指导作用。

BDHTL在广泛的生物成像应用中接受了合作实验室严格的检验：北京大学邓伍兰课题组长期运用单分子荧光成像研究基因调控的时空动态，此前一直使用JF Fluor作为单分子的标记物。她们的单分子测试结果表明BD566HTL相较与JF549HTL亮度提升19%，tracking lifetime提升70%，counting lifetime可提升300%。北京大学邹鹏课题组长期从事化学染料-蛋白质混合型膜电压荧光探针的开发，他们发现BD566HTL版本的细胞膜电压传感器Voltron2相比于JF552HTL版本在灵敏度无显著性差异的情况下光稳定性提高了260%。中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心穆宇团队使用BD566/626HTL实现了斑马鱼在体染色标记及全脑神经元3D成像。北京林业大学林金星教授是植物细胞成像专家，其实验室通过平行比较发现BD626HTL在活植物细胞膜蛋白SIM成像中观测时长相较于JF646HTL可提升20倍以上。北京大学医学部黄小帅研究员与合作者利用BD566HTL与mStayGold分别标记细胞内质网及线粒体外膜，在其最新研发的3D-MP-SIM中通过三维长时程成像观察到两者之间丰富的互作过程。BD系列荧光探针在单分子成像、植物细胞标记、活斑马鱼标记、化学遗传学探针、和新型显微镜技术研发等前沿方向中的广泛应用，展示了新一代荧光母核作为通用技术的可观潜力。

综上所述，BD系列荧光探针通过基础原理创新，不仅是染料化学领域分子设计策略的突破，而且为先进成像技术和相关生物学问题提供了实用的全系列工具包。BD系列荧光探针的设计、合成、表征及应用全面实现了国产化，这对于打破欧美国家在先进成像染料方向的垄断具有现实意义。

Nature Methods

北京大学未来技术学院2025届毕业生张钧维博士为本论文的第一作者，北京大学陈知行研究员为本论文的通讯作者。北京大学博士生张珂诚（染料-蛋白质复合物结构解析）、中科院脑科学与智能技术卓越创新中心王逵博士（斑马鱼在体成像）、北京大学博士生王波（单分子成像）、北京大学博士生朱思彦（膜电压成像）、北京林业大学博士生钱虹萍（植物细胞成像）、BSJ Institute马钰淼（理论计算）为本研究做出了重要贡献。特别感谢中科院脑科学与智能技术卓越创新中心穆宇研究员、北京大学邓伍兰研究员、北京大学邹鹏研究员、北京林业大学林金星教授、北京大学陈雷教授对本工作的大力支持和悉心指导，以及杨有军教授和Lei Wang教授对论文的审阅。

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02693-4

制版人： 十一

参考文献

学术合作组织

（*排名不分先后）

战略合作伙伴

（*排名不分先后）

（*排名不分先后）

转载须知

【非原创文章】本文著作权归文章作者所有，欢迎个人转发分享，未经作者的允许禁止转载，作者拥有所有法定权利，违者必究。

转载须知

【原创文章】BioArt原创文章，欢迎个人转发分享，未经允许禁止转载，所刊登的所有作品的著作权均为BioArt所拥有。BioArt保留所有法定权利，违者必究。

BioArt

Med

Plants

人才招聘

会议资讯

近期直播推荐