Adv Sci | 吕卫国/陆燕/许君芬团队揭示卵巢癌细胞外囊泡中的INAVA mRNA诱导正常成纤维细胞激活

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，通常在初次诊断时已发生腹腔内的广泛转移【1】。近年来，肿瘤微环境（TME）中的癌症相关成纤维细胞（CAFs）被证实是推动肿瘤进展的“幕后推手”【2】，但恶性细胞如何“驯化”正常成纤维细胞（NOFs）转化为促癌的CAFs，这一机制仍不明确。细胞外囊泡（EVs）作为细胞间通讯的重要媒介，在肿瘤细胞与间质细胞的相互作用中扮演了重要角色【3】。RNA是EVs内容物中最常见的类型，既往研究主要集中于非编码RNA，但近年来的研究发现，EVs中的mRNA可以被递送至受体细胞并翻译为功能性蛋白质，从而更直接地调控靶细胞的功能【4】。因此，本研究旨在阐明卵巢癌细胞源性EVs中的mRNA如何诱导NOFs激活，这对于深入理解卵巢癌进展的分子机制及开发新的靶向治疗策略具有重要意义。

近日，浙江大学医学院附属妇产科医院吕卫国/陆燕/许君芬团队在国际学术期刊Advanced Science上在线发表题为The INAVA mRNA in Extracellular Vesicles Activates Normal Ovarian Fibroblasts by Phosphorylation–Ubiquitylation Crosstalk of HMGA2的研究成果。该研究揭示卵巢癌源性EVs中富集的INAVA mRNA通过调控HMGA2磷酸化依赖的泛素化修饰驱动NOFs激活。研究发现，INAVA mRNA在卵巢癌患者血浆及组织源性EVs中特异性高表达，并与肿瘤分期及不良预后显著相关。机制上，INAVA竞争性抑制VRK1介导的HMGA2 Ser105磷酸化，进而阻断TRIM21介导的K48连接多聚泛素化降解，并激活STAT3转录，最终诱导NOFs激活为促癌CAFs。通过设计并合成靶向阻断INAVA-HMGA2结合的细胞穿透肽T-4，可显著抑制小鼠卵巢原位异种移植瘤模型中的肿瘤生长与腹膜转移，为临床治疗提供新策略。

本研究以正常卵巢上皮细胞系来源的EVs作为对照，通过对卵巢癌细胞系来源的EVs进行RNA测序分析，筛选并发现INAVA mRNA在卵巢癌细胞源性EVs中显著上调并呈现选择性富集。进一步通过ddPCR和RT-qPCR分析表明，INAVA mRNA在卵巢癌患者血浆和组织来源的EVs中同样呈现高表达，且表达水平与卵巢癌的转移和不良预后呈显著正相关。

为验证EVs中INAVA mRNA的生物学功能，本研究通过慢病毒敲低或过表达INAVA mRNA的卵巢癌细胞源性EVs处理正常卵巢成纤维细胞，Western Blot检测其激活相关标志物（FAP、αSMA、Vimentin、S100A4）的表达变化，并通过免疫荧光、凝胶收缩实验和迁移实验评估成纤维细胞的收缩性和运动性。最后，本研究构建了小鼠卵巢原位异种移植瘤模型，通过体内成像系统（IVIS）监测肿瘤生长和转移情况，并评估了EVs中的INAVA mRNA对小鼠生存时间的影响。通过Masson’s染色和免疫组织化学染色，进一步验证了INAVA mRNA在促进肿瘤基质重塑和成纤维细胞激活中的作用。

机制解析阶段，本研究通过免疫共沉淀联合质谱分析鉴定出INAVA的下游互作蛋白HMGA2，通过免疫荧光共定位实验和分子对接模拟验证两者的相互作用。接着，利用CRISPR/Cas9介导HMGA2基因敲除、INAVA–HMGA2共表达回复实验以及构建小鼠卵巢原位异种移植瘤模型，系统验证INAVA和HMGA2之间在诱导NOFs激活过程中的上下游调控关系。

为进一步阐明INAVA调控HMGA2的分子机制，本研究通过RT-qPCR、蛋白稳定性实验以及蛋白酶体（MG132）和溶酶体途径（氯喹）特异性抑制剂干预实验探索INAVA对HMGA2含量的调控机制。通过筛选质谱数据，鉴定出TRIM21作为介导HMGA2蛋白K48连接多聚泛素化的E3泛素连接酶，并通过免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验进行验证。同时通过构建TRIM21蛋白系列截短突变体及关键位点突变体，结合功能回复实验，鉴定其调控HMGA2泛素化的关键结构域。

此外，本研究还通过泛磷酸化水平（p-Ser/Thr）检测和牛小肠碱性磷酸酶（CIAP）去磷酸化处理明确INAVA对HMGA2蛋白磷酸化状态的影响。通过构建HMGA2蛋白磷酸化位点突变体（S/T→A）联合质谱分析鉴定其关键磷酸化位点。此外，本研究还制备了特异性识别HMGA2 Ser105位点磷酸化的单克隆抗体，并经Western Blot验证其特异性。进一步通过免疫共沉淀–质谱分析筛选、蛋白稳定性实验以及VRK1激酶野生型（WT）和失活突变型（K71M）载体构建阐明VRK1激酶活性对HMGA2 蛋白Ser105磷酸化、K48连接多聚泛素化以及NOFs激活的调控作用。

基于上述机制，本研究设计了一种靶向INAVA-HMGA2相互作用的细胞穿透肽T-4。体外实验表明，T-4肽可剂量依赖性地阻断两者结合，恢复HMGA2的Ser105磷酸化和泛素化降解，有效逆转NOFs激活。在小鼠卵巢原位异种移植瘤模型中，T-4肽治疗显著抑制肿瘤生长和腹膜转移，延长生存期，且未观察到明显毒性。这一系列成果不仅验证了靶向INAVA-HMGA2互作的治疗策略可行性，更为临床转化提供了概念性证据。

综上，本研究揭示了EVs中的INAVA mRNA在卵巢癌NOFs激活中的核心作用，为靶向肿瘤基质的精准治疗奠定了理论基础，具有显著的临床转化潜力。

浙江大学医学院附属妇产科医院吕卫国教授、陆燕教授和许君芬副教授为该研究论文的共同通讯作者，浙江大学医学院附属妇产科医院博士研究生顾凌凯、浙江大学医学院附属邵逸夫医院沈璋瑾博士为该研究论文的共同第一作者。浙江大学医学院转化医学研究院孙毅教授在文章设计和修订过程中提供了建设性意见。

原文链接：https://doi.org/10.1002/advs.202500912

制版人：十一

参考文献

[1] Lheureux S, Gourley C, Vergote I, et al. Epithelial ovarian cancer [J].Lancet, 2019, 393(10177): 1240-53.

[2] Chhabra Y, Weeraratna A T. Fibroblasts in cancer: Unity in heterogeneity [J].Cell, 2023, 186(8): 1580-609.

[3] Kalluri R, Mcandrews K M. The role of extracellular vesicles in cancer [J].Cell,2023, 186(8): 1610-26.

[4] O'brien K, Breyne K, Ughetto S, et al. RNA delivery by extracellular vesicles in mammalian cells and its applications [J].Nat Rev Mol Cell Biol, 2020, 21(10): 585-606.

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