《食品科学》：渤海大学张德福副教授等：1株多重耐药副溶血弧菌噬菌体vB_VpP_3的生物学特性及全基因组分析

副溶血性弧菌是一种广泛存在于热带、温带海洋及沿海水域的革兰氏阴性嗜盐菌。食用未煮熟或受到副溶血性弧菌污染的海产品（主要为甲壳类动物、软体动物）是造成该菌感染的主要原因。副溶血性弧菌也是水产养殖中常见的病原菌之一，能引起水生动物炎症、溃疡及死亡等，给水产养殖业造成了严重的经济损失。近年来，随着人们在临床、水产养殖以及农业等领域过量使用和滥用抗菌药物，导致包括副溶血性弧菌在 内的许多细菌出现耐药性。

裂解性噬菌体是一种具有裂解细菌能力的病毒，因其能特异性识别、裂解靶细菌而不影响其他微生物，逐渐代替抗菌药物对耐药性细菌进行防控。噬菌体也被认为是食源性病原体的天然生物防治剂。

渤海大学食品科学与工程学院的刘青青、张明和张德福*等以实验室前期保存的副溶血性弧菌为宿主菌，筛选得到1 株噬菌体vB_VpP_3并对其生物学特性和基因组特征进行研究、分析，以期为利用噬菌体治疗副溶血性弧菌造成的水产养殖动物疾病及食品原料安全控制提供参考。

1 噬菌体vB_VpP_3的分离纯化

从螃蟹中分离出1 株裂解性噬菌体，按照Adriaenssens等建议的规则命名为vB_VpP_3。该噬菌体可在双层琼脂平板上产生直径约0.6 mm、中心相对清晰透明、边缘整齐圆滑的噬菌斑，继续培养8 h后无晕圈产生（图1）。

2 噬菌体的微观形态观察

图2为噬菌体vB_VpP_3负染后的透射电镜图。vB_VpP_3头部为正二十面体，直径约60 nm，连接短的、不可伸缩约20 nm的尾部。参考国际病毒分类委员会最新制定的分类标准，初步推测噬菌体vB_VpP_3属于有尾噬菌体目（Caudovirales）中的短尾噬菌体科（Podoviridae）。

3 噬菌体的效价及常规稀释度

通过双层平板法对噬菌体的效价进行测定，噬菌体vB_VpP_3的效价为3.55×108 PFU/mL，活性较高，其常规稀释度为10－6。

4 副溶血性弧菌噬菌体的最佳MOI

最佳MOI可以用于确定抑制一定浓度细菌生长所需要的最少噬菌体数量。如表1所示，通过双层平板法测定噬菌体vB_VpP_3的最佳MOI为0.1，效价最高可达到3.55×108 PFU/mL。

5副溶血性弧菌噬菌体的裂解谱分析

使用本实验室保存的11 株耐药性副溶血性弧菌、2 株副溶血性弧菌标准株及1 株溶藻弧菌Va2001作为宿主菌测试噬菌体裂解谱。如表2所示，噬菌体vB_VpP_3的裂解谱相对较窄，宿主特异性较强，成斑率略低，对受试菌株中的3 株敏感（1 株标准株、2 株来源于养殖污水）。

6 噬菌体吸附率分析

如图3所示，噬菌体vB_VpP_3的吸附曲线显示出两个阶段，迅速吸附阶段集中在0～5 min，吸附速率较快。5 min后噬菌体进入吸附速率缓慢期，在20 min时噬菌体吸附率达到峰值，为93%，20 min后出现轻微下降。

7噬菌体的一步生长曲线

由图4可知，噬菌体vB_VpP_3的潜伏期约15 min，爆发时间持续85 min，细菌裂解释放大量噬菌体，导致噬菌体效价快速上升，100～140 min为平缓期。全裂解周期约持续120 min，平均裂解量为110 PFU。

8 噬菌体pH值稳定性和热稳定性分析

如图5a所示，噬菌体vB_VpP_3在40～50 ℃区间活性没有明显变化，在60～70 ℃环境下处理1 h后噬菌体效价下降严重，在80 ℃条件下处理1 h后噬菌体完全失活。这可能 是高温破坏了蛋白质的空间结构，使噬菌体的受体结合蛋白丧失结合能力而无法裂解细菌所致。

如图5b所示，噬菌体vB_VpP_3在pH 5～10时活性最高，效价可达约108 PFU/mL；当pH≤2或pH≥13时噬菌体vB_VpP_3完全失活。强酸及强碱环境会影响噬菌体的活性，但对碱性环境的整体耐受性强于酸性环境。

9噬菌体对氯仿的敏感性分析

噬菌体vB_VpP_3经过氯仿处理后效价由8.91（lg（PFU/mL））下降至8.11（lg（PFU/mL）），但变化幅度较小，结果表明噬菌体对氯仿不敏感，说明衣壳蛋白中不存在脂溶性物质，可用氯仿在应用前进行除菌而不影响噬菌体的活性，也可使用氯仿作为后续基因组抽提等实验的辅助试剂。

10 噬菌体的体外生物防治能力分析

如图6所示，随着时间的延长，各组细菌不断繁殖，混合液的OD595 nm不断升高，其中空白对照组增长速率最快。不同MOI噬菌体对宿主菌均有不同程度的抑制作用，培养4 h后空白对照组的OD595 nm持续上升，当处理组MOI＝0.1时，0～4 h内其OD595 nm保持在0.2以下，4 h后逐渐上升，但仍然低于空白对照组的上升速率，表明在最佳MOI条件下，噬菌体vB_VpP_3对副溶血性弧菌有明显的抑制作用。

11噬菌体vB_VpP_3的生物被膜清楚能力分析

如图7所示，随着时间的延长，对照组的OD595 nm逐渐升高，而空白组的OD595 nm始终在0.1左右，表明副溶血性弧菌具有形成生物被膜的能力。在不同时间点实验组的OD595 nm都显著低于对照组，说明该噬菌体对副溶血性弧菌生物被膜具有显著的抑制作用，抑制率约为60%～66%。

12 噬菌体全基因组的基本生物学信息分析

噬菌体vB_VpP_3为双链线性DNA，基因组全长42 459 bp，序列中GC含量为46.87%，无重复区域，相对较为保守，其基因组图谱如图8所示。经预测，vB_VpP_3不具备编码tRNA的基因，在侵染完成后需要借助宿主菌的tRNA完成蛋白 合成，且不携带已知毒力基因与耐药基因，不存在水平传播的风险。全基因组共包含45 个ORFs（表3），编码蛋白的基因占据全基因组长度的88.91% ，结构相对紧密，编码蛋白的最长基因长度为3 855 bp，平均长度860 bp。 通过GenBank数据库比对发现较多相似度较高的全基因序列，多数为有尾的弧 菌属噬菌体。

13噬菌体全基因组功能注释及蛋白图谱分析

噬菌体vB_VpP_3所包含的45 个ORFs经多种数据库对比后确认了34 个ORFs的基因功能，其余11 个ORFs被认为是假想蛋白（图9），大部分ORFs比对相似性较高，处于90%以上。该噬菌体没有毒力基因、耐药基因，预测的蛋白可按照功能划分为4 个模块：DNA代谢相关蛋白、噬菌体结构和组装蛋白、裂解细菌的相关蛋白以及其他功能蛋白。DNA代谢相关蛋白包括DNA解旋酶（ORF16、ORF25）、DNA聚合酶（ORF18）、DNA结合蛋白ORF22）、核酸内切酶（ORF27）、RNA聚合酶（ORF31）。其中RNA聚合酶是短尾噬菌体科的重要标志，DNA聚合酶、核酸外切酶及内切酶与噬菌体MGD1相似度高达98%。噬菌体结构与组装蛋白包括颈部连接蛋白（ORF34）、衣壳蛋白（ORF36）、尾纤维蛋白（ORF38、ORF43）、尾管蛋白（ORF39）。其中，衣壳蛋白序列较为保守，与弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2衣壳蛋白相似度为99%，负责特异性识别的尾管蛋白及尾纤维蛋白 相似性较低。其他功能蛋白包括甲基转移酶（ORF29）、腺嘌呤甲基转移酶（ORF35）等。穿孔素（ORF28）是在噬菌体中起裂解作用的膜蛋白，能够调节裂解周期，通过在细胞膜上形成跨膜孔而介入细菌裂解过程。

14噬菌体进化关系与比较分析

为了解噬菌体vB_VpP_3与其他噬菌体之间的进化 关系，通过从GenBank数据库上寻找到33 株相似性达到 90%以上的噬菌体全基因组构建系统发育树（图10）。 它们均以副溶血性弧菌为宿主菌，且大多数来源于亚洲。结果显示vB_VpP_3与来源于中国的弧菌噬菌体vB_VpP_DE10（MZ516827.1）最相似，相似性达到96%。

末端酶大亚基在噬菌体驱动DNA包装和易位中起关键作用，基于末端酶大亚基的系统发育树 显示，噬菌体vB_VpP_3与来源于美国的弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2（NC_048036.1）具有极高的相似性（图11a）。衣壳蛋白与噬菌体组装、分类 密不可分，而基于衣壳蛋白的系统发育树显示，噬菌体vB _VpP_3与弧菌噬菌体vB_VpP_DE10属于同一进化分支（图11b）。综合对比可确定弧 菌噬菌体vB_VpP_3是1 株典型的短尾噬菌体。

选取相似性最高的2 株弧菌噬菌体vB_VpaP_KF2和vB_VpP_DE10与vB_VpP_3进行线性比较，结果如图12所示，3 株噬菌体的全基因组相似度达到78%以上。其中，结构与包装蛋白、其他蛋白模块相似度最高，差异主要集中在15～20 kb之间，这是因为噬菌体基因发生了插入等现象。

讨论与结论

由于全球变暖和水产养殖业的集约化发展，导致弧菌感染率逐渐增加，而多重耐药菌更是成为了治疗细菌感染的主要障碍。英国政府的报告指出，如果无法有效解决细菌耐药性问题，预计到2050年全球将导致1 000多万人死亡以及产生高达100万亿美元的经济损失。因此寻找解决细菌耐药性的新疗法至关重要，基于噬菌体低耐药性的特点，利用其控制副溶血性弧菌感染的方法逐渐受到研究人员的青睐。NCBI数据库记录了超过6万条噬菌体基因信息，但目前关于副溶血性弧菌噬菌体仅有2 700条，所以丰富其基因信息尤为重要。

噬菌体能否作为抗生素替代药物的关键在于其生物 学特性。与其他副溶血性弧菌噬菌体相比，噬菌体vB_VpP_3对宿主表现出较强的特异性、较短的吸附时间（5 min）和较大的裂解量，意味着该噬菌体在治疗过程中具有保护宿主局部微生物群的优势以及易于纯化、增殖和工业化制备。噬菌体的环境稳定性也是其作为生物制剂的先决条件，噬菌体vB_VpP_3比噬菌体BP14在pH值和温度方面有更强的耐受性，vB_VpP_3在70 ℃条件下仍有存活，在pH 3或pH 12环境下也具有活性，能 够更好地适应各个加工环节。在噬菌体制剂快速发展的背景下，未来将有更多的噬菌体被分离出来，对噬菌体进行明确的分类也非常重要。透射电子显微镜观察结果显示噬菌体vB_VpP_3有短的不可收缩的尾部，根据形态分类法，将其归类于Podoviridae。

细菌生物被膜是能够附着在物体表面的微生物群落，一旦形成就难以根除。生物被膜的形成会增强细菌的免疫机制，导致细菌耐药性增加。副溶血性弧菌在合适的环境条件下，能在海产品和非生物表面形成生物被膜，其具有的几丁质酶使其在生物被膜形成方面更有优势，因此抑制生物被膜的形成也是控制副溶血性弧菌感染的一个重要措施。噬菌体可以破坏生物被膜基质以抑制其形成。本实验结果表明，噬菌体vB_VpP_3处理12 h后就产生了明显效果，12～48 h抑制了60%～66%生物被膜的形成。这与Yin Yujie等的研究结果相一致。

噬菌体编码的多糖解聚酶存在标志性特征为噬菌斑周围的晕圈，而基因组分析结果表明噬菌体vB_VpP_3不含多糖解聚酶基因，与噬菌斑结果一致。另外，噬菌体vB_VpP_3具有穿孔素且缺乏溶原功能相关的基因，证明了该噬菌体是1 株裂解性噬菌体。穿孔素是一种小分子疏水跨膜蛋白，以寡聚体的形式聚集并在细胞膜上形成跨膜孔使细胞破裂，同时通过质子动力变化使细胞膜去极化，从而控制噬菌体裂解时间。目前已经有研究将穿孔素用于抑制耐药菌的生长和破坏生物被膜，Lu Han等重组表达了志贺氏菌属噬菌体的穿孔素，证明穿孔素能显著抑制细菌生长和生物被膜形成，Xiang Yingying等体外表达了粪肠球菌噬菌体的穿孔素，与原噬菌体相比，穿孔素具有更高的裂解活性和更宽的宿主谱，同时在清除生物被膜形成方面更有效。穿孔素的特异性、低耐药性使其为食源性致病菌的预防提供了新的思路。

本研究从生物特性和基因组方面进行研究，验证了噬菌体vB_VpP_3是裂解期短、释放量大、感染能力强的裂解性噬菌体，具有较强的环境耐受性且不携带抗菌素耐药性决定簇和毒力基因，也没有与噬菌体溶原相关的整合酶基因，表明该噬菌体具有在水产养殖领域的应用潜力。因此噬菌体vB_VpP_3可以作为水产养殖控制副溶血性弧菌感染的候选抗菌剂。

作者简介

通信作者：

张德福，博士，渤海大学食品科学与工程学院副教授，硕士生导师。主要从事食源性致病菌快速检测与生物防控及相关方面的教学与科研工作，主持有“十三五”国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项子课题、国家自然科学基金青年基金、中国博士后科学基金面上项目等。目前主要开展噬菌体生物学、基因组学及其在食品安全检测与致病菌控制中的应用。

第一作者：

刘青青，渤海大学食品科学与工程学院硕士研究生。

2017/9-2021/6，贵州大学食品科学与工程学院，攻读学士学位，专业：食品科学与工程，导师：王修俊教授。

2022/9-2025/6，渤海大学食品科学与工程学院，攻读硕士学位，专业：食品加工与安全，导师：张德福副教授。

本文《 1 株多重耐药副溶血弧菌噬菌体vB_VpP_3的生物学特性及全基因组分析 》来源于《食品科学》2024年45卷第24期108-116页，作者： 刘青青，张明，杨雯静，刘可， 李凡， 李学鹏，励建荣，张德福。DOI:10.7506/spkx1002 -6630-20240621-147 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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