《食品科学》：南京师范大学郭宇星教授等：副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白及其黏附性能分析

乳酸菌是一类利用碳水化合物发酵并产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，主要有嗜酸乳酪杆菌（Lacticaseibacillus acidophilus）、干酪乳酪杆菌（L. casei）、副干酪乳酪杆菌（L. paracasei）和鼠李糖乳酪杆菌（L. rhamnosus）等。乳酸菌因具有良好的发酵特性且能够在人体内发挥维持肠道屏障、提高免疫力等重要功能，而被广泛应用于食品工业中。副干酪乳酪杆菌K56是内蒙古伊利实业集团股份有限公司分离自儿童肠道且目前已被广泛应用的安全性发酵商业菌株，相关研究报道了副干酪乳酪杆菌K56具有调节肠道菌群、缓解肥胖和相关代谢紊乱疾病的功效。乳酸菌能够对宿主肠道产生生理作用的重要前提是能有效黏附于肠上皮细胞，这种黏附作用可分为非特异性黏附和特异性黏附。

南京师范大学食品与制药工程学院的吴梵、马国文、郭宇星*等以副干酪乳酪杆菌K56为目标菌株，首先通过研究其在胃肠道环境中的耐受性、疏水性和自聚性等益生性能，阐释其在肠道内发挥益生功能的具体作用机制；其次通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离纯化、液相色谱-质谱（LC-MS）鉴定其表面蛋白，初步研究去除表面蛋白前后副干酪乳酪杆菌K56对黏蛋白、胶原蛋白和Caco-2细胞的体外黏附能力，阐释表面蛋白介导肠道细胞黏附作用，旨在为解析副干酪乳酪杆菌K56调节肠道功能作用提供理论基础，并为其在益生菌领域的产品开发与应用拓展新的方向。

1副干酪乳酪杆菌K56的益生特性

1.1副干酪乳酪杆菌K56人工胃肠液耐受性

乳酸菌的耐胃肠道消化能力是评判乳酸菌是否具有潜在益生特性的重要指标。本研究以鼠李糖乳酪杆菌LGG和实验室保藏的干酪乳酪杆菌NSD-1为对照菌株，鼠李糖乳酪杆菌LGG是目前研究最为广泛的商业益生菌之一，在人体胃肠道中具有良好的黏附能力，干酪乳酪杆菌NSD-1在实验室前期研究中已被证明具有高酸和胆汁耐受性。如表1所示，在胃液中消化2 h，副干酪乳酪杆菌K56存活率为（94.90±2.96）%，消化3 h存活率为（88.78±3.31）%，刘银辉等的研究表明副干酪乳酪杆菌RH17965在人工胃液中处理3 h存活率为84.30%；唐素婷等在研究副干酪乳酪杆菌HT31益生性质时，发现菌株在胃液中耐受3 h后存活率为86.33%。相比而言，本实验中副干酪乳酪杆菌K56对胃液的耐受能力更强。将菌液转接到人工肠液中继续培养2 h，副干酪乳酪杆菌K56存活率为（91.57±2.24）%，显著高于对照菌株干酪乳酪杆菌NSD-1（P＜0.05），表现出良好的人工胃液耐受能力。

1.2副干酪乳酪杆菌K56抑菌能力与抗氧化活性

图1A～C为3 种乳酸菌对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制作用。其中，副干酪乳酪杆菌K56对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有显著的生长抑制作用，抑菌圈直径分别为（19.91±0.24）mm和（19.00±0.22）mm，优于刘妍妍研究中副干酪乳酪杆菌NCU622对大肠杆菌（（14.17±1.04）mm）和金黄色葡萄球菌（（14.57±0.40）mm）的抑制作用。乳酸菌通过竞争性占位在宿主肠黏膜上形成生物屏障，同时产生有机酸、过氧化氢或分泌细菌素，抑制病原菌生长。

如图1D所示，副干酪乳酪杆菌K56 CFS的DPPH自由基清除率为（96.29±0.21）%，显著高于CFE和IC（P＜0.05），3 株乳酸菌CFS中可能存在超氧化物歧化酶、胞外多糖、醛类和多酚类等物质，具有强抗氧化活性和抑菌能力，对指示菌具有抑制作用。如图1E所示，副干酪乳酪杆菌K56 CFE、IC的Fe3+还原能力与干酪乳酪杆菌NSD-1相比无显著差异（P＞0.05）。如图1F所示，副干酪乳酪杆菌K56的总抗氧化能力显著高于鼠李糖乳酪杆菌LGG（P＜0.05）。副干酪乳酪杆菌K56强抗氧化特性使其在食品加工中具备改善食品风味、延长保质期和减少自由基积累等有益作用。综上可知，副干酪乳酪杆菌K56凭借优良的胃肠道耐受性、抑菌性和抗氧化能力，可以更好地在肠道中发挥益生能力。

1.3副干酪乳酪杆菌K56的表面疏水性、自凝聚性

由图 2A可知，副干酪乳酪杆菌K56对二甲苯的表面疏水性为（26.24±0.53）%，显著高于对照菌株鼠李糖乳酪杆菌LGG与田原等研究的副干酪乳酪杆菌L1。细菌表面疏水性与其表面蛋白等结构相关，疏水性较高的菌株，对肠道具有较高的黏附能力。副干酪乳酪杆菌K56对氯仿的亲和力明显高于对乙酸乙酯的亲和力（P＜0.05），说明其供电能力更强。氯仿为单极、酸性溶剂，可作为电子受体用于评测菌体表面的供电子能力；而乙酸乙酯为单极、碱性溶剂，作为电子供体用于评测菌体表面的得电子能力。

乳酸菌的自凝聚作用是其黏附肠道细胞的第1步，有助于在宿主肠道内黏附定植。由图2B可知，随着时间的延长，副干酪乳酪杆菌K56的自聚性也不断提高，在整个静置过程中自凝聚能力均高于对照菌株干酪乳酪杆菌NSD-1，5 h的自凝聚率达到（28.47±1.19）%，高于干酪乳酪杆菌NSD-1（（22.87±1.24）%）和赵雪婷等6 h测得的干酪乳酪杆菌NCU011056自凝聚率（（28.29±1.69）%），较高的自凝聚能力可能使副干酪乳酪杆菌K56具有较高的肠上皮细胞黏附能力，在胃肠道环境中具有竞争优势。

2 副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白对肠上皮细胞黏附能力的分析与鉴定

2.1副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白的提取工艺优化

乳酸菌特异性黏附主要是细菌表面黏附素与细胞表面或者黏附受体相结合。酸性氯化锂属于强阳离子解离剂，能够破坏细菌表面蛋白中以非共价键形式存在的氢键，提取表面蛋白的同时不会使菌体失去活性。从图3A可以看出，酸性氯化锂比盐酸胍溶液提取的表面蛋白含量高。当菌体与酸性氯化锂料液比为1∶3（g/mL）时，所提取的表面蛋白质量浓度最高（图3B）。当处理时间为30 min与40 min时，提取蛋白质量浓度最高，两组无显著差异（P＞0.05）（图3C）。因此，确定了副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白的提取工艺：每1 g菌体中加入3 mL的5 mol/L酸性氯化锂溶液（pH 2.0），冰水浴处理30 min提取表面蛋白。

如图4所示，5 mol/L酸性氯化锂法提取的副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白条带在25～50 kDa比较集中，在10～17、70～95 kDa和170～180 kDa处也有条带分布。

2.2去除表面蛋白前后副干酪乳酪杆菌K56的体外黏附能力

由图5A、C可知，副干酪乳酪杆菌K56对黏蛋白、胶原蛋白和Caco-2细胞的黏附率分别为（78.70±3.41）%、（80.06±0.75）%和（11.98±0.09）%，对蛋白的黏附能力显著优于干酪乳酪杆菌NSD-1（P＜0.05），与鼠李糖乳酪杆菌LGG对胶原蛋白的黏附能力无显著差异（P＞0.05），副干酪乳酪杆菌K56对Caco-2细胞的黏附能力优于Bengoa等从开菲尔中分离的副干酪乳酪杆菌CIDCA 8339。副干酪乳酪杆菌K56对蛋白和Caco-2细胞具有良好的体外黏附能力。

为进一步验证表面蛋白在乳酸菌黏附过程中发挥的作用，对去除表面蛋白的乳酸菌黏附蛋白和Caco-2细胞的能力进行了探究，Caco-2细胞作为成熟的肠上皮细胞模型，可用于研究益生菌的黏附性。如图5B、C所示，去除表面蛋白后，副干酪乳酪杆菌K56对黏蛋白、胶原蛋白和Caco-2细胞的黏附率分别为（71.00±0.41）%、（71.29±1.02）%和（8.92±0.21）%，黏附率分别下降了7.70%、8.77%和3.06%。由此推测表面蛋白可作为黏附因子帮助乳酸菌定植于肠道。

如图6A所示，绿色荧光为FITC标记的副干酪乳酪杆菌K56，蓝色为Hoechst 33342标记的Caco-2细胞核，可以清晰地看到副干酪乳酪杆菌K56大量黏附于Caco-2细胞表面，而去除表面蛋白的副干酪乳酪杆菌K56对细胞的黏附数量明显降低（图6B）。

2.3副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白的鉴定

本课题组前期对嗜酸乳酪杆菌、罗伊氏乳酪杆菌、干酪乳酪杆菌的表面蛋白进行了研究，发现不同乳酸菌表面蛋白组成存在差异性。嗜酸乳酪杆菌S-层蛋白为表面蛋白的主要成分，具有黏附肠道细胞作用而发挥肠道免疫调节活性；罗伊氏乳酪杆菌LPXTG基序蛋白为表面蛋白的主要成分，介导了与肠道细胞的黏附，具有抗炎、抗氧化等作用。本研究通过对副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白进行鉴定，发现副干酪乳酪杆菌K56主要包括LPXTG基序蛋白如LPXTG细胞壁锚定蛋白（170 kDa）、转肽酶（30 kDa）、含LPXTG结构域蛋白（46 kDa）和兼职蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶（37 kDa）、伴侣蛋白GroEL（58 kDa）、烯醇化酶（47 kDa）、热不稳定延伸因子（44 kDa）、伴侣蛋白GroES（10 kDa）等（表2），与2.2.1节中SDS-PAGE条带分布范围一致。

有研究表明，乳酸菌的表面蛋白组分可以与黏附受体相互作用，如约翰逊乳酪杆菌EF-Tu可结合人体细胞和黏蛋白，卷曲乳酪杆菌的GPI可结合层黏连蛋白和胶原蛋白，Sortase突变可降低乳酸菌对Caco-2细胞的黏附。本研究发现，副干酪乳酪杆菌K56对黏蛋白、胶原蛋白和Caco-2细胞的黏附能力强，去除表面蛋白后黏附能力均下降，可能是其表面存在的LPXTG基序蛋白和兼职蛋白相互作用，共同发挥黏附因子功能从而介导肠道细胞黏附。另外，副干酪乳酪杆菌K56具有良好的胃肠道耐受性能及益生性能，推测其表面蛋白在介导细菌黏附和发挥生物效应方面起到了至关重要的作用，具体黏附的作用机制仍需进一步探索。

结论

本实验以副干酪乳酪杆菌K56为研究对象，研究其在胃肠道环境中的耐受性、黏附特性和表面蛋白介导副干酪乳酪杆菌K56黏附肠上皮细胞中的作用。结果表明，副干酪乳酪杆菌K56在模拟胃肠液环境中存活性能良好；具有高疏水性和高自凝聚性；对黏蛋白、胶原蛋白和Caco-2细胞有良好的黏附能力。副干酪乳酪杆菌K56存在多种表面蛋白，其表面蛋白凭借独特的理化特性可能对菌株耐胃肠液能力、表面性质和黏附产生积极影响，从而介导副干酪乳酪杆菌K56与胞外基质、肠上皮细胞的黏附及发挥生物学效应。通过LC-MS鉴定出副干酪乳酪杆菌K56的LPXTG基序蛋白和多种兼职蛋白，如热不稳定延伸因子、烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶，可能对肠上皮细胞的黏附具有决定性的作用。本研究可为后续副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白的功能和黏附机制解析奠定基础。

作者简介

通信作者：

郭宇星，教授、博士生导师，南京师范大学科学技术研究院副院长、食品与制药工程学院副院长。江苏省“333高层次人才培养工程”培养对象；南京师范大学百名青年领军人才；南师大青蓝工程优秀骨干教师；南师大优秀教师、优秀党务工作者；美国加州大学戴维斯分校访问学者。先后主持国家自然科学基金4 项，江苏省农业科技自主创新资金等省级项目10余项；发表SCI及EI论文100余篇，申请及授权国家发明专利30余项；分别获江苏省、浙江省科技进步奖二等奖2 项、宁波市科技进步二等奖2 项。

本文《副干酪乳酪杆菌K56表面蛋白及其黏附性能分析》来源于《食品科学》2024年45卷第22期94-102，作者：吴 梵，马国文，曾照中，洪维鍊，倪 丹，郭宇星*。DOI : 10.7506/spkx1002-6630-20240213-070。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：林安琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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