《食品科学》：江西中医药大学曹雷鹏博士等：米曲霉固态发酵豆粕制备肽螯合铜的结构及稳定特性

铜是人体生长发育中必需的微量金属元素，是机体内蛋白质和酶的重要组成成分。铜摄入量缺乏会严重影响器官功能和代谢。尽管膳食铜可从各种动物和植物来源的食物中获取，但其吸收利用率低、摄入量有限。肽或氨基酸铜螯合物作为第3代新型的铜补充剂，能直接以无机盐形式进入生物体内，在小肠内迅速消化吸收，可大大提高机体对铜的利用率，同时也可为人体提供丰富的氨基酸和多肽等营养成分。研究表明，肽金属螯合物有着独特的螯合体制和转运机制，比氨基酸金属螯合物具有更好的生物利用度、吸收率和稳定性，具有更大的发展前景和商业价值。

豆粕（SBM）是大豆榨油过程中产生的副产物。SBM中粗蛋白含量高达43%～48%，且氨基酸组成平衡，是富含赖氨酸（2.5%～2.8%）的植物性蛋白原料。但SBM中含有抗营养因子如大豆凝聚素、植酸、脲酶、胰蛋白酶抑制剂和致敏蛋白等，严重限制SBM的消化、吸收及其高效利用。米曲霉（

Aspergillus oryzae

江西中医药大学院士工作站的温子轩、曹雷鹏*和南昌大学生物质转化教育部工程研究中心的周悦等人 以低成本、高蛋白的SBM为原料，通过米曲霉固态发酵制备可用于螯合Cu 2+ 的豆粕肽（l peptide，SBMP），并探究SBMP螯合Cu 2+ 的作用效果及机制，表征其结构功能特性，以期为SBM的高值化利用及豆粕肽-铜螯合物的低成本生产提供理论支撑。

1 不同分子质量SBMP螯合Cu2+能力

研究表明，肽的螯合能力与其分子质量、结构、氨基酸组成和空间效应密切相关 。如图1所示，SBMP分子质量由＞50 kDa降低至＜1 kDa时，其螯合Cu2+能力由（47.64±0.79）mg/g显著增加至（202.84±1.33）mg/g（ P ＜0.05）。其中，1～5 kDa SBMP螯合Cu 2+ 能力达到最大值，为（241.46±1.51）mg/g，比未处理组增加203.34%，表明1～5 kDa SBMP螯合Cu 2+ 能力最强，这可能是肽链中氨基酸类型和数量差异导致。本实验结果与先前报道的结果 基本一致，低分子质量肽具有良好的螯合能力。Sun Runan等 以南极磷虾原料制备新型金属螯合肽，发现1～3 kDa南极磷虾肽螯合Zn2+ 能力最大，这部分南极磷虾肽含量占总肽的（42.18±0.29）%。因此，本研究选择分子质量为1～5 kDa的SBMP用于后续实验。

2 1~5 kDa SBMP的分离纯化

DEAE-Sephadex作为一种常用的弱阴离子交换剂，广泛用于肽的多级分离纯化 。如图2a所示，1～5 kDa SBMP经DEAE-Sephadex梯度洗脱后出现两个明显对称尖锐的峰，分别命名为组分F1和组分F2。组分F1在30～60 min之间出峰，此时NaCl浓度维持在0 mol/L，其可能归因于洗脱上样后未结合在色谱柱上的物质。组分F2在130～160 min之间出峰。根据DEAE-Sephadex柱的阴离子交换分离原理，可推测组分F2表面的负电荷多于组分F1。Sun Runan等 的研究也表明随着阴离子交换洗脱时间的延长，多肽组分的负电荷越多。

如图2c所示，组分F2螯合Cu2+能力高达（276.09±2.88）mg/g，显著高于组分F1（（147.18±2.75）mg/g），比纯化前提高了14.34%，其可能归因于组分F2中螯合Cu2+的肽浓度及其所带负电荷的提高。由于DEAE-Sephadex柱广泛应用于肽的初步分离，并非最终分离的色谱柱，其主要原因是相同性质的肽类在该阶段可能会发生重叠现象，因此，选取组分F2用于继续纯化。

凝胶层析法是基于不同分子质量和电荷特性分离纯化蛋白的技术 。图2b为组分F2经葡聚糖凝胶G-25洗脱后的曲线。组分F2经葡聚糖凝胶G-25纯化后得到一个对称尖锐的峰，命名为组分F3，出峰时间在50～200 min。洗脱结束后，测得组分F3螯合Cu 2+ 的能力为（288.47±2.18）mg/g，比F2提高了4.48%，可能归因于组分F3中螯合肽浓度的提高。因此，后续选取组分F3利用液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）进行肽序列的鉴定。

3 螯合肽的序列分析鉴定

肽的氨基酸组成和序列与其螯合Cu2+的能力密切相关。表1显示了1～5 kDa SBMP纯化后所得组分F3中的寡肽及其序列。组分F3中共有27 个寡肽，其主要由5～10 个氨基酸组成，分子质量在570～1 500 Da范围内。每种寡肽都含有丰富的酸性氨基酸（天冬酰胺Asn、谷氨酸Glu），除了肽片段EQDIFVIPA（Glu-Gln-Asp-Ile-Phe-Val-Ile-Pro-Ala）、EDDVFVIPA（Glu-Asp-Asp-Val-Phe-Val-Ile-Pro-Ala）外，其余肽段均含有1～2 个碱性氨基酸（精氨酸Arg、组氨酸His、赖氨酸Lys），表明1～5 kDa SBMP中的酸性氨基酸和碱性氨基酸均在螯合Cu2+的过程中发挥了重要作用。谷氨酸和天冬氨酸中—C＝O上的自由电子为Cu2+提供空轨道，形成配位键。赖氨酸ε-氨基氮、精氨酸胍基氮、组氨酸咪唑基也可能与Cu2+螯合。较高浓度的疏水性氨基酸和丝氨酸及其磷酸化羟基在促进抗氧化和金属螯合等生物活性方面也发挥着重要作用。质谱数据显示，组分F3的肽中富含疏水性氨基酸（甘氨酸Gly、缬氨酸Val、亮氨酸Leu、异亮氨酸Ile、脯氨酸Pro），且部分肽片段含有丝氨酸及其磷酸化羟基。经ToxinPred网站（http://crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/index.html）毒性评价表明27 个寡肽均无毒。

4 1~5 kDa SBMP及SBMP-Cu(II)的结构表征

4.1 紫外-可见吸收光谱和FTIR分析

紫外-可见吸收光谱可通过新吸收峰的出现或原吸收峰的置换或消失反映金属离子与肽之间的可能螯合机制 。如图3a所示，SBMP和SBMP-Cu(II)在近紫外区和部分可见光区存在明显差异。SBMP在234 nm波长处出现最强吸收峰，对应于肽中的羰基、羧基和酰胺基 ，在267 nm波长处出现弱吸收峰，对应芳香族氨基酸的π-π*跃迁 。SBMP螯合Cu2+ 后，分别蓝移至211、251 nm波长处，这表明SBMP上的C＝O、COOH、—OH、—N H 2 与Cu 2+ 结合后发生变化。FTIR是探究肽与金属离子反应机制的常用方法之一，金属离子与有机基团之间的配位反应导致其吸收峰发生变化。图3b显示了SBMP和SBMP-Cu(II)在4 000～400 cm -1 的红外光谱，具有明显差异的SBMP高频吸收峰位于3 403.74 cm -1 处，由—NH的伸缩振动引起，螯合Cu 2+ 后，吸收峰蓝移至3 430.74 cm -1 ，表明—NH的电子云密度由于Cu 2+ 与N形成配位键而变得更强 。酰胺I带（C＝O拉伸振动）的峰值从1 627.63 cm -1 蓝移至1 666.34 cm -1 。此外，1 382.71 cm -1 代表—COOC—对称拉伸模式的峰经Cu 2+ 螯合后在1 430.92、1 361.50、1 322.93 cm -1 处裂解成3 个不规则吸收带，这表明羧基氧的非键合自由离子转移到Cu 2+ 上，导致—COO—Cu的形成 。吸收带位于1 047.56 cm -1 （—C—O—拉伸振动和—OH变形振动），螯合Cu 2+ 后蓝移至1 110.80 c m -1 ，这可能是由—C—O—Cu的形成引起。 综上所述，推断SBMP与Cu 2+ 的主要结合位点是肽上的羧基氧、羟基氧、氨基氮和碳氧。许庆陵等 在罗非鱼多肽铜螯合物中也发现了FTIR光谱的类似变化。

4.2 1~5 kDa SBMP及SBMP-Cu(II)的微观结构、元素和Zeta电位分析

微观形态特征是对样品最直观的描述。图4a显示了SBMP和SBMP-Cu(II)在SEM下放大500 倍和2 000 倍的微观结构。SBMP表面光滑，有细小裂纹，可能是发酵液在快速真空冷冻干燥过程中产生的。然而，SBMP-Cu(II)表面更粗糙、松散，并且有许多球形聚集体，表面有类似晶体的颗粒附着，两者形态结构存在明显差异。推测肽和Cu2+之间发生了螯合反应，致使肽表面原有的结构发生了破坏，形成了很多肽-金属螯合物小颗粒聚集体。

如图4b所示，与SBMP相比，SBMP-Cu(II)中Cu质量分数大幅增加，为22.14%，表明SBMP与Cu 2+ 发生了螯合反应。同时SBMP-Cu(II)中的C、N、O相比于SBMP有不同程度的减少，这与2.4.1节所得结论相印证。

Zeta电位用于反映多肽溶液表面的电荷状态。如图4c所示，SBMP-Cu(II)的Zeta电位为（-27.00±0.14）mV，相比于SBMP（（-31.30±0.28）mV）增加13.74%，电位绝对值显著下降，表明Cu 2+ 在螯合反应时中和了一些负电荷，如羧基（—COOH）、羟基（—OH）等。这与Sun Runan等 的研究结果一致。

4.3 TG和XRD分析

如图5a所示，SBMP的TG曲线主要分为3 个阶段：第1阶段（0～133 ℃）为自由水蒸发散失阶段；第2阶段（133～366 ℃）为结合水的释放和有机成分的分解阶段；第3阶段（366～900 ℃）为肽键的断裂阶段。而SBMP-Cu(II)的曲线整体更加平缓，与SBMP有显著差异，可分为4 个阶段：第1阶段（0～121 ℃）为自由水释放阶段；第2阶段（121～244 ℃）仅下降4.73%，为结合水和有机成分分解阶段；第3阶段（244～299 ℃）质量仅损失35.51%，质量恒定温度在700 ℃，总质量损失率为49.78%，远低于SBMP（86.72%）。因此，SBMP及SBMP-Cu(II)的最高耐受温度分别不应超过133 ℃和244 ℃。SBMP-Cu(II)具有较高的热稳定性。

XRD通常用于评估分子晶体的形态变化和空间结构特点。如图5b所示，SBMP最强峰出现在大约23°处，并在大约30°、33°、39°、43°、45°处形成小而尖但强度较弱的峰，表明SBMP的晶体结构不规则。然而当SBMP与Cu2+螯合后，在21°、24°出现清晰、高强度的尖峰，最强峰左移，并在大约29°、31°附近形成小而尖的峰，表明螯合作用使分子晶体结构发生变化，生成了含铜离子的特定晶体结构，且晶型较好。这可能是氨基酸残基与Cu2+之间相互作用造成，与2.3节结论相印证。

5 1~5 kDa SBMP和SBMP-Cu(II)的稳定性分析

5.1耐酸碱、耐热性及耐盐性分析

根据样品中游离氨基氮质量分数和Cu 2+ 释放率评价SBMP-Cu(II)的稳定性 。如图6a所示，在不同pH值环境中SBMP-Cu(II)的游离氨基氮质量分数均低于SBMP，且SBMP各组间变化不大，表明SBMP-Cu(II)相较于SBMP在pH 2.0～8.0的稳定性大幅提升。SBMP-Cu(II)在pH 2.0时Cu2+ 释放率最低，为（16.93±0.42）%，之后随着pH值增大而逐渐升高，在pH 6.0时达到最大值，为（33.04±0.17）%，可推测在较中性或碱性条件下会促使Cu(OH) 2 的形成，导致SBMP-Cu(II)的解离释放Cu 2+ 。因此，SBMP-Cu(II)具有较高的耐酸性。

如图6b所示，在40～90 ℃环境中SBMP-Cu(II)的游离氨基氮质量分数均低于SBMP。随着温度的上升，SBMP-Cu(II)的Cu2+释放率呈先上升后下降趋势，于80 ℃达到最大值，为（24.96±0.25）%，在90 ℃时下降至（23.60±0.67）%，整体维持在（23.01±0.17）%～（24.96±0.25）%之间，说明SBMPCu(II)具有较强的耐热性，且在温度低于70 ℃时螯合物较为稳定。

如图6c所示，随着NaCl浓度的增加，SBMP与SBMPCu(II)的游离氨基氮质量分数总体呈现平稳的趋势；SBMP-Cu(II)的Cu2+释放率随着NaCl浓度的增加呈现逐渐上升趋势，均维持在31%以下，当NaCl浓度为1.0 mol/L时达到最高值，为（30.44±0.17）%，这表明SBMPCu(II)在0～1.0 mol/L NaCl条件下具有良好的耐盐性。以上结果表明，SBMP-Cu(II)在耐酸性、耐热性、耐盐性方面均优于SBMP。

5.2体外模拟胃肠消化

胃肠道中各种蛋白酶可以使SBMP-Cu(II)解离并影响其溶解度和生物可及性。因此，螯合物对胃蛋白酶和胰蛋白酶的耐受性常用于评估其消化稳定性。如图7所示，胃消化60～120 min时Cu2+释放率始终维持在（18.25±0.96）%～（19.48±0.09）%，无显著差异，表明胃蛋白酶对螯合物的水解影响不大，SBMPCu(II)在胃消化阶段具有良好的稳定性，具有促进铜在胃中吸收利用的潜力，可以降低铜对胃部的刺激。Wen Qingmei等也报道了小分子质量肽对胃蛋白酶的敏感性低。然而在120 min的肠消化过程中，Cu2+释放率显著增加，在120～240 min Cu2+释放率始终维持在（35.59±1.21）%～（37.23±1.11）%。综上推测，在强酸性环境下（胃液pH 2.0）避免了OH-与Cu2+竞争SBMP结合位点，有利于螯合反应的发生，该结果与2.5.1节结果相印证。此外，胰蛋白酶的存在可能导致肽的分子构象发生改变，使其稳定性及与Cu2+的结合能力降低，Cu2+易从螯合物中解离出来。经胃肠道消化240 min后，SBMP-Cu(II)始终维持在较低的游离氨基氮质量分数（（40.37±0.93）%），显著低于SBMP（（47.69±0.15）%），表明SBMP-Cu(II)在胃肠道环境中的消化稳定性均高于SBMP，SBMP-Cu(II)可作为新型铜补充剂有效提高Cu2+在胃肠道环境的生物可及性。

结 论

本实验采用米曲霉固态发酵制备具有螯合Cu 2+ 能力的SBMP，并分析鉴定出螯合Cu 2+ 的最佳SBMP分子质量为1～5 kDa，经阴离子层析和凝胶层析色谱分离纯化后，其螯合Cu 2+ 能力可高达（288.47±2.18）mg/g。LCMS/MS、FTIR和SEM分析表明SBMP-Cu(II)的结构与SBMP存在显著差异，可能是由于SBMP氨基、羧基、羟基和咪唑基团与Cu 2+ 的螯合作用。此外，SBMP-Cu(II)具有较高的耐酸性和耐热性，且在模拟胃肠道消化环境下，SBMP-Cu(II)可促进机体胃肠道对Cu 2+ 的吸收。本研究表明SBMP-Cu(II)可有效提高Cu 2+ 的生物可及性，为新型Cu 2+ 补充剂和SBM蛋白资源高值化利用提供科学依据。后续应进一步研究其促进Cu 2+ 吸收的确切机制以及体内Cu 2+ 吸收效率。

作者简介

通信作者：

曹雷鹏，讲师，江西中医药大学院士工作站、南昌大学生物质转化教育部工程研究中心。1.个人学习及工作经历：2023.05至今 江西中医药大学院士工作站；2019.10—2023.04 南昌大学环境科学与工程专职博士后 （导师：吴代赦、刘玉环研究员）；2018.9—2019.9 美国Ohio State University 访问学者；（导师：生物系主任，Harold Keener）；2016.9—2019.6 南昌大学食品科学与工程博士学位（导师：长江学者-阮榕生、刘玉环）；2013.9—2016.6 上海海洋大学食品工程硕士学位 （导师：东方学者-黄轶群，赖克强）；2009.7—2013.6 浙江杭州中萃食品有限公司，负责产品质量检测；2005.9—2009.6 广西中医药大学获食品科学与工程学士学位。2.研究方向：1)2023年至今 窄叶鲜卑花多糖的功能活性及作用机制的研究，食品药同源产品的开发；2)2019年-2023年，多糖功能性食品及抗菌肽、鳌合金属肽产品的研发；3)2017年-2019年，水中氮磷等营养物质的回收利用及重金属的去除，主要利用微藻养殖技术、水肥一体化等技术实现水中氮磷等营养物的资源化回收利用，同时开发重金属吸附剂有效去除水中的重金属；4)2016—2017年，生物质固定化酶技术的研究及螺旋藻功能性食品的开发，主要利用毛竹纤维对蛋白质酶的固定，以实现蛋白酶的重复利用；5)2013—2016年，鱼肉保鲜技术研究，主要包括冷藏、冷冻及冰藏等保鲜技术对鱼肉品质的影响及近红外光谱技术快速检测鱼肉品质模型的建立。3.获得荣誉：1) 2 021年获第一届大学生仲园-珍宝杯柚子创新创意大赛“三等奖”；2)2018年获浩瀚杯“创青春”江西省大学生创业大赛创业计划竞赛“银奖”。4.科研成果：近5年来以第一作者或通讯作者已发表论文23篇，其中 SCI 15篇（一区9 篇，二区3 篇，三区2 篇，四区1 篇），EI 2篇， CSCD核心6 篇 ，授权 专利3 项。

本文 《米曲霉固态发酵豆粕制备肽螯合铜的结构及稳定特性》来源于《食品科学》2024年45卷第22期85-93页，作者：温子轩，周悦，黄正花，李斌，刘玉环，郑逢曼，曹雷鹏。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240308-060。 点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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