《食品科学》：南阳师范学院杨树琼博士等：绿豆7S球蛋白基因鉴定及在籽粒发育中的表达分析

作物种子中的贮藏蛋白是人类获取蛋白质的重要来源之一，尤其在种子成熟过程中大量合成并储存，主要为种子萌发提供氮源、碳源和硫源。球蛋白是种子贮藏蛋白的主要成分，其中豆类植物种子的贮藏蛋白以7S和11S球蛋白含量最高。研究表明，7S球蛋白具有多种生物学功能，如抑制α-淀粉酶活性，延缓淀粉消化，降低肥胖症患者的内脏脂肪及血脂血糖等。然而，部分cupin蛋白是植物性食物过敏原，如大豆7S球蛋白等。绿豆作为中国重要的食用豆类作物，其籽粒中的主要贮藏蛋白是7S、8S和11S球蛋白，但目前对绿豆7S球蛋白编码基因的研究较少。随着植物全基因组测序技术的发展，绿豆已完成基因组测序组装，为Vr7S球蛋白编码基因的全基因组水平鉴定提供了条件。

基于绿豆全基因组数据，南阳师范学院生命科学与农业工程学院的丁冬会、张雨朋、杨树琼*等通过生物信息学手段鉴定绿豆全基因组内的7S球蛋白编码基因，并对基因结构与保守基序、编码蛋白特征、系统发育和不同籽粒发育时期表达特性进行分析，以期为研究该家族基因的功能提供科学依据。

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Vr7S球蛋白基因的全基因组鉴定结果

在绿豆全基因组中共鉴定到10 个7S球蛋白基因，依次命名Vr7S A、B1～B9，其编码蛋白理化性质如表1所示。10 个Vr7S球蛋白基因编码蛋白的氨基酸长度为246～594 个氨基酸，其中序列最长的为Vr7S B7，最短的是Vr7S B1；分子质量范围为27.82～70.02 kDa，多数在49.15～51.80 kDa之间；脂肪系数为71.03～95.17；总平均亲水性均小于0，为-0.999～-0.319，表明Vr7S蛋白均疏水；pI变化范围是5.02～6.40，均呈酸性。

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Vr7S球蛋白的基因结构、蛋白结构预测分析结果

利用MEME对Vr7S球蛋白序列进行保守基序预测发现，Vr7S B1、Vr7S B4含5 个保守基序，Vr7S B6含6 个保守基序，其余球蛋白均含有8 个保守基序（图1A）；蛋白结构域分析发现，8 个Vr7S球蛋白具有2 个cupin结构域（cupin_7S_vicilin_like_N和cupin_7S_vicilin_like_C），Vr7S B4有2 个cupin结构域（cupin_7S_vicilin_like_N和cupin_RmIC_like_superfamily），而Vr7S B1仅有1 个cupin结构域（cupin_7S_vicilin_like_C）（图1B）；基因结构分析发现，Vr7S B6和Vr7S B7含有7 个外显子、6 个内含子，Vr7S A、Vr7S B2、Vr7S B3、Vr7S B5和Vr7S B8这5 个基因含6 个外显子、5 个内含子，Vr7S B1和Vr7S B9含3 个外显子、2 个内含子，Vr7S B4含4 个外显子、3 个内含子（图1C）。

利用SWISS-MODEL软件对10 个Vr7S球蛋白的三级结构进行预测，发现它们共有4 种类型的结构，其中Vr7S A、Vr7S B2、Vr7S B3、Vr7S B5、Vr7S B7、Vr7S B8及Vr7S B9具有第1种蛋白结构特征（图2A）；Vr7S B4具有第2种蛋白质结构特征（图2B）；Vr7S B1具有第3种蛋白质结构特征（图2C）；Vr7S B6具有第4种蛋白质结构特征（图2D）；通过图2中的预测，发现Vr7S球蛋白有6 个亚基，每个亚基由多个β-链构成，每2 个亚基之间由α-螺旋连接。

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绿豆与其他物种7S球蛋白基因的cupin结构域比对及系统发育分析结果

为了鉴定绿豆与其他物种7S球蛋白基因的系统进化关系，对16 条7S球蛋白的cupin结构域序列进行了比对分析，其中包括1 条大豆、1 条赤豆、1 条野生大豆、1 条木豆、1 条短绒野大豆、1 条相思子、1 条菜豆和9 条绿豆。在第1个cupin结构域cupin_7S_vicilin_like_N中，9 个绿豆与7 个其他物种的7S球蛋白基因的氨基酸序列共有30 个完全保守的位点（星号标记），其中甘氨酸（glycine，G）、亮氨酸（leucine，L）和脯氨酸（proline，P）最多（图3A）。而在第2个cupin结构域cupin_7S_vicilin_like_C中，绿豆和其他物种的氨基酸序列共有37 个完全保守的位点（星号标记），其中缬氨酸（valine，V）、丙氨酸（alanine，A）、甘氨酸（glycine，G）和天冬酰胺（asparagine，N）居多（图3B）。

依据46 条不同物种7S球蛋白cupin结构域序列间的相似性，分析了绿豆与其他物种7S球蛋白基因的系统进化关系（图4）。构建的NJ进化树显示，46 个7S球蛋白基因被分为5 组，C3组包含了2 对旁系同源基因，仅有1 个成员Vr7S B7，C4组有9 个Vr7S球蛋白基因，其中Vr7S B4和Vr7S B5、Vr7S B8和Vr7S B9具有很高的序列相似性，推测其可能是旁系同源的基因对。

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Vr7S球蛋白基因表达谱分析结果

绿豆Vr7S球蛋白基因在不同籽粒发育时期的RNASeq表达谱分析显示（图5），所有Vr7S球蛋白基因在花后0 d和10 d籽粒中不表达或表达量较低，除了Vr7S B4在花后15 d籽粒中的表达量高于花后25 d籽粒中的表达量外，其余基因都是花后25 d籽粒中的表达量明显高于花后15 d籽粒中的表达量，推测在绿豆籽粒成熟中后期，Vr7S球蛋白基因在绿豆蛋白生成调控方面发挥了重要作用。

进一步探讨Vr7S球蛋白基因在绿豆蛋白生产调控方面的作用，利用RT-PCR对其在4 个绿豆品种、不同籽粒发育时期中的表达量进行了检测（图6）。在绿豆品种G041和G141中，所有Vr7S球蛋白基因在花后10 d籽粒中不表达，在花后15 d和25 d籽粒中均出现表达上调；在WT和G120中，所有Vr7S球蛋白基因在花后10 d籽粒中有少量表达，在15 d和25 d籽粒中表达量明显增加；在4 个绿豆品种中，RT-PCR检测的基因表达模式与RNA-Seq检测的基因表达模式整体趋势一致，这些结果表明Vr7S球蛋白基因对绿豆籽粒成熟中后期蛋白生成调控具有积极作用。

作为我国传统药食兼用的食材，绿豆素有“食中佳品，济世长谷”之美称，其清热、消暑、解毒、保肝等功能为人们所熟知。目前，国内外对绿豆淀粉的加工利用过程中，基本忽略了对绿豆蛋白等副产物的充分开发。作为重要的食用豆资源，绿豆同样富含清蛋白、球蛋白等蛋白质，且氨基酸种类丰富、配比合理，赖氨酸含量较高且与鸡蛋蛋白相近，营养价值较高。作为豆类蛋白的主要组分之一，7S球蛋白对食用豆蛋白的结构、功能特性及物理化学性质起着决定性的作用。陈海敏等研究发现，7S球蛋白与大豆蛋白乳化性及乳化稳定性呈正相关，其更强的疏水性能大大提升了对油脂的吸附率。7S球蛋白还可通过抑制α-淀粉酶的活性延缓淀粉的消化，其控制血糖升高功效已成为当前研究的热点。

本研究基于绿豆全基因组数据库共鉴定了10 个Vr7S球蛋白基因，每一个Vr7S球蛋白与其他植物球蛋白一样，均由6 个亚基组成，并具有保守的球蛋白cupin结构域。不同物种7S球蛋白的保守cupin结构域序列比对发现，绿豆与其他物种7S球蛋白的cupin结构域间共有67 个保守的氨基酸残基，其中有天冬酰胺10 个、甘氨酸9 个。研究表明天冬酰胺和甘氨酸对球蛋白的正确折叠起关键作用，这可能是天冬酰胺和甘氨酸在物种间保守性高的原因。通过系统发育分析可以看出，绿豆与赤豆7S球蛋白基因间的同源关系最近，其次是菜豆、木豆及大豆等，说明这些近缘物种间的7S球蛋白基因可能具有相似的功能，也对Vr7S球蛋白基因功能研究提供重要依据。

豆科物种7S球蛋白基因参与了籽粒贮藏蛋白的生成调控过程，并伴随籽粒发育而合成直至籽粒成熟。Kazłowski等研究发现绿豆籽粒在花后11～21 d的连续发育阶段其储藏蛋白含量显著增加，预示着绿豆籽粒发育中后期储藏蛋白基因的高表达。Vr7S球蛋白作为绿豆贮藏蛋白的主要组成成分，其调控基因的表达量也会随着绿豆籽粒的成熟而升高。基于RNA-Seq和RT-PCR表达谱探究了绿豆10 个7S球蛋白基因在不同绿豆品种、花后不同发育时期籽粒中表达量的变化，Vr7S球蛋白基因伴随着绿豆籽粒的发育成熟呈现表达量升高的趋势，这与其他豆科物种7S球蛋白基因的表达模式相一致，也表明了Vr7S球蛋白基因在绿豆籽粒贮藏蛋白的生成调控过程中具有积极作用。本研究为进一步解析Vr7S球蛋白基因在绿豆中的生物学功能奠定了基础，也为高品质、专用性绿豆新品种培育提供了基因资源。

本文《绿豆7S球蛋白基因鉴定及在籽粒发育中的表达分析》来源于《食品科学》2024年45卷第12期109-115，作者：丁冬会，张雨朋，周人玲，席武洋，杨树琼*。DOI :10.7506/spkx1002-6630-20230726-292。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：农梦琪；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

为深入探讨未来食品在大食物观框架下的创新发展机遇与挑战，促进产学研用各界的交流合作，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心、国家市场监督管理总局技术创新中心（动物替代蛋白）及中国食品杂志社《食品科学》杂志、《Food Science and Human Wellness》杂志、《Journal of Future Foods》杂志主办，西华大学食品与生物工程学院、四川旅游学院烹饪与食品科学工程学院、西南民族大学药学与食品学院、四川轻化工大学生物工程学院、成都大学食品与生物工程学院、成都医学院检验医学院、四川省农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院都市农业研究所、四川大学农产品加工研究院、西昌学院农业科学学院、宿州学院生物与食品工程学院、大连民族大学生命科学学院、北京联合大学保健食品功能检测中心共同主办的“第二届大食物观·未来食品科技创新国际研讨会”即将于2025年5月24-25日在中国 四川 成都召开。

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