J. Future Foods | 牡丹果荚经碱处理、酶水解和微生物发酵制成聚羟基丁酸酯的技术研究

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Introduction

聚-β-羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）是一种天然产物，用于保存微生物能量并参与代谢过程。PHB材料环保无毒，具有良好的生物相容性，在材料工程学中应用广泛，可用作药物缓释载体，热加工性能良好，在农用和食用包装材料等方面也具有潜在应用价值。此外，PHB在环境中可完全降解成水和二氧化碳，对人体没有危害，在环境压力和能源危机日益严峻的今天，受人们普遍关注。

利用廉价碳源（如活性污泥、木质素、纤维素等）合成PHB，是生产PHB的一大研究方向。牡丹是我国特有的木本花卉和药用植物，每年有大量牡丹籽被采收用于生产牡丹籽油。在实践中，牡丹果荚和牡丹籽通常一起进行采收，在晾晒后再进行分离，导致产生大量的果荚弃置物。弃置物堆积废弃从而造成环境污染，或者被产地农民当做低值柴薪使用。研究中发现，牡丹弃置物中木质纤维素（纤维素、半纤维素、木质素）含量丰富，如何利用木质纤维素提高牡丹果荚的利用率成为亟待解决的问题。

山东省农业科学院王军华博士、周庆新（共同第一作者）、陈蕾蕾研究员、奥本大学王易芬教授（共同通信作者）等采用碱法预处理牡丹果荚，利用酶水解得到的还原糖为碳源，使用重组大肠杆菌（含pBHR68质粒）发酵制备PHB，拓展牡丹果荚综合利用新路径。

Results

生物质样品的傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析

FTIR光谱显示预处理前后吸收峰的形状和强度存在差异。预处理后，1 722 cm−1处的吸收峰消失，源于半纤维素支链中的未偶联羰基断裂；1 240 cm−1处的吸收峰高度降低，是由于半纤维素和木质素之间的连接断裂。此外，处理组的吸收峰高度在1 376 cm-1处降低，表明半纤维素中的C—H键部分断裂。而一些吸收峰没有显著改变，包括3 426、2 919、1 425 cm−1，表明预处理未破坏纤维素。2 种碱预处理方式，微波加热和水浴加热，对纤维素-木质素的破坏作用无显著差异。

图1 不同处理的牡丹果荚的FTIR图谱

酶水解生成还原糖及其水解产物分析

相同pH值条件下，柠檬酸钠作为缓冲溶液，纤维素酶水解效果更充分，酶解效率提高了37.40%。酶解24 h，还原糖产量显著增加，36 h水解完全。料液比在1%～6%之间，酶解充分，此后酶解产量大幅降低，源于溶液的粘稠度增加，反而导致酶解不充分。随着酶添加量增加，还原糖产量先增加后降低，在1 000 U/g，还原糖产量最高。优化后确立纤维素酶水解工艺：50 mmol/L柠檬酸钠（pH 5.0）为缓冲溶液，纤维素酶添加量为1 000 U/g，料液比为4%，反应时间36 h。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化法从制备的还原糖中检测出甘露糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖。其中，主要成分为葡萄糖和木糖，含量分别为77.13%和19.90%，占总检出还原糖的97.03%。元素分析结果则表明，该还原糖中氮含量极少，仅为0.095%；氮含量为31.69%。

图2 不同酶水解条件下的还原糖产量

PHB结构表征和制备

重组大肠杆菌JM109（含pBHR68质粒）为生产菌株，以酵母提取物为氮源、酶解还原糖为碳源进行发酵。目标产物经次氯酸钠/氯仿提取、丙酮纯化，根据核磁氢谱和FTIR分析确证其结构。核磁氢谱1H NMR中存在PHB单体羟基丁酸特征峰。FTIR峰形也与对照样品一致。

图3 PHB结构表征

基于核磁氢谱检测技术，PHB标准品为阳性对照，用内标法以定量分析发酵液中的PHB含量。结果显示，不添加氮源，发酵产物中未检出PHB，这表明氮源对重组大肠杆菌的生长和PHB产生是必不可少的。进而对不同氮源（酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆粉、酪蛋白和硫酸铵）进行筛选。玉米浆粉和酵母浸粉有利于PHB的积累，尤其是玉米浆粉。较之其他氮源（蛋白胨、酪蛋白和硫酸铵），以玉米浆粉作为氮源，PHB产量至少提高160%。相较于市售的葡萄糖，等量酶解还原糖作为碳源，PHB产量提高36.67%。

1.酶解还原糖（FRS）；2. FRS和酵母浸粉；3. FRS和蛋白胨；4. FRS和玉米浆粉；5. FRS和酪蛋白；6. FRS和硫酸铵；7. 葡萄糖和酵母浸粉。

图4 影响PHB产量的碳源和氮源筛选

Conclusion

水浴加热碱法处理牡丹果荚，连接半纤维素和木质素的化学键被破坏。纤维素酶水解后，还原糖产量增加了27.15%。优化酶解参数，建立了高效的还原糖酶解制备参数。以酶解还原糖为碳源，经大肠杆菌发酵转化后，1H NMR和FTIR分析确证终产物为PHB。玉米浆粉作为氮源，PHB产量最高；酶解还原糖作为碳源时，较之葡萄糖，PHB产量提高36.67%。该研究为PHB的商业生产提供廉价原材料，并为园艺废弃物处理提供科学解决方案。

Polyhydroxybutyrate production from Paeonia ostii pods by alkaline pretreatment and enzymatic hydrolysis followed by microbial fermentation

Junhua Wang a1, Qingxin Zhou a1, Jiying Qiu a, Yanhao Zhang a, Xiangyan Chen a, Yifen Wang b, Leilei Chen a

a Institute of Food Nutrition Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China

b Biosystems Engineering Department, Auburn University, Auburn 36849, USA

1 These authors contributed equally to this work.

*Corresponding author.

Abstract

To further develop the tree peony (Paeonia ostii) industry, methods for reusing the peony pods were explored, which are only used as low-value firewood. In the study, pods were subjected to alkaline pretreatment to produce fermentable reducing sugar for polyhydroxybutyrate (PHB) production. Fourier transform infrared (FTIR) results and reducing sugar yields for samples subjected to alkaline pretreatment were better than those for untreated samples, and the reducing sugar yield increased by 27.15%. The degree of hydrolysis and reducing sugar yield were increased by optimizing enzymatic parameters. The produced reducing sugar had carbon and nitrogen content of 31.69% and 0.095%, respectively, and most carbon came from glucose and xylose. The reducing sugar was fermented using a recombinant Escherichia coli strain, and the product was confirmed to be PHB by FTIR and proton nuclear magnetic resonance (1H NMR) analyses. The PHB yield increased by 36.67% when the produced reducing sugar, instead of glucose, was used as the carbon source. Meanwhile, corn steep liquor increased PHB production more significantly than the other tested nitrogen sources. The results of the study can promote the further development of the tree peony industry for commercial biodegradable PHB production by providing economical biomass.

Reference:

WANG J H, ZHOU Q X, QIU J Y, et al. Polyhydroxybutyrate production from Paeonia ostii pods by alkaline pretreatment and enzymatic hydrolysis followed by microbial fermentation[J]. Journal of Future Foods, 2025, 5(5): 513-519. DOI:10.1016/j.jfutfo.2024.08.009.

文章翻译由作者团队提供

编辑：龚艺；责任编辑：孙勇

封面图片来源：摄图网

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