江南大学成功改造枯草芽孢杆菌，实现乙偶姻高效生物合成

乙偶姻是一种有机化合物，主要用作食用香料，用于配制奶油、乳品、酸奶和草莓等，也用于有机合成。在食品、制药、化妆品等众多领域应用广泛。

乙偶姻在工业上主要通过化学方法合成，但这种方法依赖不可再生的化石原料，且生产过程中的自由基取代反应还会对环境造成破坏。于是，科学家们将目光投向了微生物发酵法，其中，枯草芽孢杆菌因其安全性高，底物利用范围广以及基因编辑操作性强等优势，被视为生产乙偶姻的理想微生物。然而在利用枯草芽孢杆菌生产乙偶姻时，常常面临着生产效率低、发酵周期长、成本高等难题。

近期，由江南大学张显教授团队主导的一项题为“Efficient Acetoin Production in Bacillus subtilis by MultivariateModular Metabolic Engineering with Spatiotemporal Modulation”的研究成功攻克了这些难题，研究人员通过多变量模块化代谢工程与时空调控等策略，成功实现利用枯草芽孢杆菌，将葡萄糖高效转化生产为乙偶姻。

首先，研究人员选用野生型枯草芽孢杆菌 JNA 3-10 作为基础菌株，通过基因编辑技术，研究人员克隆了枯草芽孢杆菌中的一些关键基因，比如 alsS、alsD、yodC ；合成了锌指蛋白编码序列、结合碱基序列、丝氨酸整合酶 Bxb1 逻辑门电路序列等；采用融合 PCR 技术，将不同的基因片段巧妙连接，构建出融合蛋白基因并插入到特定的质粒中，得到初始菌株 BM，初步实现了葡萄糖通过转化为乙偶姻，随后，研究人员又采取多种策略对该菌株进行改造升级。

删除非必需功能基因以重新分配碳通量。研究人员发现，如果删除枯草芽孢杆菌中的部分非必需基因，可以减少非必要代谢活动对能量和物质的消耗，如 eps 基因簇和 spoIIE 基因等。eps 基因编码细胞外多糖，与蛋白质和核酸一起构成枯草芽孢杆菌的生物膜。在营养充足、环境适宜的乙偶姻发酵生产条件下，删除 eps 基因簇不会对细胞生理造成额外负担，反而可以节省能量用于细胞生长和产物合成。实验结果显示，删除 eps 基因簇的重组菌株 JNA01 的最大生物量显著增加，与原始菌株 BM 相比，OD₆₀₀ 在稳定期维持在约 21。JNA01 在消耗相同量底物时，乙偶姻产量更高。

随后，在敲除 JNA01 的另一基因 spoIIE 后得到了 JNA02，尽管敲除该基因后，菌株无法形成完整的椭圆形孢子，但是其 OD₆₀₀ 最大值和乙偶姻最高产量分别为 23.0 和 34.8 g/L，与原始菌株 BM 和重组菌株 JNA01 相比，JNA02 的乙偶姻摩尔转化率增加了 6%。

促进核心酶 ALS 和 ALDC 表达。在乙偶姻合成过程中，ALS 和 ALDC 这两种酶起着关键作用。研究人员利用周期特异性启动子 PsrfA 并优化起始密码子，并引入 5′ - UTR 序列来调控这两种酶的表达。优化后，ALS 的酶活力提高了 1.4 倍，ALDC 的酶活力最高达到 68.2 U/mg，是原来的 5.09 倍。重组菌株 JNA07 的乙偶姻最大效价达到 40.2 g/L，是之前菌株的 1.2 倍，生产速率为 1.4 倍，效率再次升级。

利用 DNA 支架提高乙偶姻合成效率。在实验步骤中，当枯草芽孢杆菌催化丙酮酸转化为乙偶姻时，中间产物 α- 乙酰乳酸并不稳定，有氧条件下会自发脱羧形成二乙酰。因此，快速高效地催化 α- 乙酰乳酸转化为乙偶姻对乙偶姻生产至关重要。在生物细胞质中，当含有相应锌指结合位点的 DNA 支架存在于细胞中时，DNA 支架会特异性地与修饰过的融合蛋白结合。

研究人员利用质粒作为稳定且可配置的 DNA 支架，平衡和调节不同蛋白的锚定比例。通过不同比例的 ALS 和 ALDC 结合序列（1:1、1:2和2:1）的支架共定位和近端排列 ALS 和 ALDC 后，结果显示，这一策略显著提高了乙偶姻生产率，且随支架结构比例变化。在发酵 36 h时，重组菌株 JNA08、JNA09 和 JNA10 的乙偶姻产量分别是重组菌株 JNA07 的 1.40、1.59 和 1.51 倍。

逻辑门电路调节代谢途径辅因子水平，增强能量供应。发酵过程中，细胞内的 NAD⁺ 和 NADH 水平对乙偶姻合成影响很大。科学家利用丝氨酸整合酶 Bxb1 构建逻辑门电路，在发酵 48 h 时诱导 NADH 氧化酶表达。结果显示，重组菌株 JNA11N 细胞内的 NAD⁺ 水平明显提高，乙偶姻的生产速率和葡萄糖的消耗速率也都提高了。JNA11N 的乙偶姻最大效价达到 44.3 g/L，NADH 依赖的副产物大幅减少，不过乙酸的效价有所增加。

研究人员推测，这一现象主要因为 DNA 支架结构防止了乙偶姻合成途径中的酶在细胞内扩散，缩短了细胞内的反应距离，进一步保护了不稳定的中间体，防止了不同途径之间对底物的竞争，最终促进了酶反应的有序进行。

最终，通过删除非必需基因、优化关键酶表达、利用 DNA 支架和逻辑门电路等一系列策略对枯草芽孢杆菌进行代谢工程改造后，乙偶姻的生产效率得到了显著提高。在 5 L 生物反应器中对重组菌株 JNA11N 和起始菌株 BM 进行补料分批发酵后，JNA11N 展现出了强大的生产能力。其乙偶姻最高效价达到 97.5 g/L，生产速率为 1.81 g/L/h，分别是 BM（原始菌株） 的 1.97 倍和 2.24 倍，而且 2,3-丁二醇等副产物的积累明显减少。这意味着该团队成功为利用枯草芽孢杆菌高效生产乙偶姻提供了新的途径。

参考文献：

1.https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssuschemeng.4c06511?articleRef=test(

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