《食品科学》：宁夏大学范艳丽副教授等：枸杞叶黄酮对HepG2细胞脂质代谢的影响及作用机制

枸杞（Lycium barbarum L.）叶是茄科枸杞属植物枸杞的嫩叶。枸杞叶中富含多种活性成分与营养物质，且枸杞叶中的黄酮类化合物含量远高于枸杞果实，展现出有潜力的资源利用价值与加工应用前景。 枸 杞叶黄酮（LBLF）作为一种具有多种生物活性的天然化合物，拥有多种生物学功能，如预防和治疗肥胖、高脂血症、糖尿病、癌症、心脏病、骨质疏松以及保肝等。课题组前期通过超高效液相色谱-质谱联用和高效液相色谱鉴定出LBLF含有芦丁、绿原酸、山柰酚、槲皮素、白杨素等11种黄酮类化合物，其中芦丁含量最高，为70%左右。此外，黄酮类化合物被认为是开发营养健康食品、功能性食品和临床辅助药物的重要来源。

宁夏大学食品科学与工程学院的杨超、裴宇芳和范艳丽*等以LBLF为研究对象，用油酸诱导培养、LBLF干预培养HepG2细胞后，检测细胞内脂滴积聚情况、相关脂质水平以及氧化应激指标，并测定脂质代谢过程中重要转录因子和相关酶的表达水平及AMP活化蛋白激酶（AMPK）信号表达情况，探究LBLF干预对油酸诱导HepG2细胞脂质代谢紊乱的作用及潜在机理，以期为进一步阐明LBLF在预防和治疗脂质代谢紊乱方面的潜在作用提供理论支持。

1 不同浓度受试物干预对HepG2细胞存活率的影响

由图1A可知，油酸的浓度与HepG2细胞的活力呈现剂量依赖性，随着油酸浓度增大细胞活力下降。在0.4 mmol/L油酸干预24 h时细胞存活率仍然保持在90%以上，说明此干预条件对细胞的正常生长不会产生明显的影响，因此考虑选择油酸浓度0.4 mmol/L干预24 h构建油酸诱导细胞模型。

由图1B可知，LBLF质量浓度与HepG2细胞活力没有显著的剂量依赖关系，LBLF干预12、24、48 h与空白组相比细胞存活率无显著差异，相比干预12 h而言，干预24、48 h细胞存活率随浓度的增大有影响，但无显著抑制作用。为确保后续细胞培养过程中维持正常生长状态，将LBLF的质量浓度设定为40、60、80 μg/mL，并将干预时间设定为24 h，以便进行后续实验。

由图1C可知，随着奥利司他质量浓度的增加，细胞活力逐渐减弱。奥利司他质量浓度为49.6～99.2 μg/ mL干预24 h时，与空白组相比其细胞存活率无显著差异；在148.7～198.3 μg/mL时存在显著差异（P＜0.05）；当其质量浓度为247.9～396.6 μg/mL时，与空白组相比细胞存活率极显著降低（P＜0.01）；因此选择奥利司他质量浓度为198.3 μg/mL、干预时间为24 h构建阳性对照模型。

2 LBLF对HepG2细胞中脂滴积累的影响

如图2A所示，空白对照组的细胞呈蓝色，细胞边缘清晰，细胞内有极少的红色脂滴存在。相比于空白对照组，模型对照组细胞内有明显的红色脂滴生成。而与模型对照组相比，随着LBLF质量浓度的增加，细胞内红色油滴量逐渐减少，80 μg/mL LBLF干预效果最好，说明LBLF干预可以在一定程度上抑制油酸诱导的细胞内脂滴积累；而奥利司他的抑制效果最明显。综上可知，体外细胞高脂模型建模效果较好。如图2B所示，与模型对照组相比，LBLF与奥利司他干预均使细胞中脂质积累的相对含量减少，随着LBLF质量浓度的增加，其降脂效果愈明显，同时降脂效果与LBLF呈剂量依赖性。

3LBLF对HepG2细胞TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影响

如表2所示，与空白对照组相比，模型对照组细胞中甘油三酯（TG）和总胆固醇（TC）含量极显著上升（P＜0.01），表明脂质在细胞内的积累量增加。随着LBLF质量浓度的增加，细胞内TG和TC含量逐渐减少，当LBLF质量浓度达到80 μg/mL时，与模型对照组相比，细胞内的TG、TC含量分别下降了40.70%、27.69%，作用效果最佳，结果表明LBLF具有降低油酸诱导HepG2细胞脂肪积累的作用。此外，模型对照组相较于空白对照组，其LDL-C含量极显著上调（P＜0.01），但HDL-C含量极显著下降（P＜0.01）。随着LBLF质量浓度的增加细胞内LDL-C含量逐渐下降，HDL-C含量呈现逐渐上升的趋势，当LBLF质量浓度达到80 μg/mL时，与模型对照组相比细胞内的LDL-C含量下降了25.94%，HDL-C含量上升了47.29%，其作用效果最佳。结果表明LBLF可以有效抑制由油酸引起HepG2细胞内TG、TC、HDL-C和LDL-C水平的异常变化，从而维持细胞内胆固醇水平的相对恒定。但同时还观察到部分组别的TC含量大大低于HDL-C含量，对HepG2细胞脂质代谢的许多研究中都观察到空白组细胞的HDL-C含量较高，这种情况的发生可能是HepG2细胞自身的生理状态或基础代谢活性导致，或者细胞培养基的成分与培养时间以及实验过程中的温度等条件可能影响细胞脂质合成和代谢，从而影响HDL-C的水平，导致LDL-C和HDL-C的总量大大超过TC。

4LBLF对HepG2细胞氧化应激指标的影响

由表3可知，与空白对照组相比，模型对照组MDA含量极显著上调（P＜0.01）。40、60、80 μg/mL LBLF干预组的MDA含量较模型对照组均极显著下调（P＜0.01），同时呈现剂量依赖关系。在本实验中，高质量浓度的LBLF处理有效抑制了油酸诱导的细胞MDA水平异常。

从表3可以看出，与空白对照组相比，模型对照组的SOD、GSH和CAT活力均极显著下调（P＜0.01）；40、60、80 μg/mL LBLF干预组和阳性对照组的SOD、GSH、CAT活力较模型对 照组均极显著上调（P＜0.01），同时呈现剂量依赖关系。实验结果表明LBLF通过提高HepG2细胞的SOD、CAT、GSH活力和降低MDA水平逆转并减轻氧化应激，保护HepG2细胞避免遭受氧化损伤。体外抗氧化性结果证明，LBLF提高了自由基清除能力，其抗氧化作用可能随着摄入对机体产生影响，恢复肝脏中的氧化应激还可以通过超氧自由基干扰脂质代谢和肝脂肪变性。

如图3所示，与空白对照组相比，模型对照组处理后细胞的ROS荧光强度明显增强；在干预24 h后，不同质量浓度的LBLF显示出不同的效果，随着LBLF质量浓度的增加，细胞的ROS荧光强度逐渐减弱。这些研究结果表明，LBLF可以有效减少 细胞内的ROS水平；80 μg/mL LBLF干预组细胞荧光强度逐渐减弱，缓解了细胞遭受的氧化应激损伤。相比于LBLF干预组，阳性对照组的荧光强度最弱。游离脂肪酸的氧化会产生大量的ROS，而这些ROS的积累会引发线粒体膜的脂质氧化反应，从而进一步加剧线粒体的氧化应激状态。LBLF相较于奥利司他效果较弱，但是目前临床治疗脂质代谢紊乱的药物均无普遍适用性，LBLF提取物作为天然的原料对后期开展抗肥胖的动物研究提供了参考。

5 LBLF提取物对脂质相关蛋白水平的影响

如图4所示，LBLF介导的SREBP-1c表达降低，可以视为ACC、FAS和SCD-1的表达降低。据报道，异槲皮素促进AMPK的活化可增强AdipoR1表达并抑制SREBP-1c/FAS表达，从而减少大鼠肝癌细胞中的脂质积累。这与本研究结果一致，表明LBLF提取物对AMPK信号传导的调节可能是其在肝细胞中发挥抗脂肪生成作用的重要机制。与脂肪酸吸收和脂质相关的蛋白质主要有过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（CEBPα）、磷酸化AMP K（p-AMPK）和AMPK。如图4所示，与模型处理组相比，40、60、80 μg/mL LBLF干预组的HepG2细胞中SREBP-1c、PPARγ、CEBPα蛋白水平极显著下调（P＜0.01），且p-AMPK/AMPK的比值明显上调（P＜0.01），LBLF干预后可显著逆转油酸对AMPK磷酸化的抑制。这些结果表明，LBLF可能通过抑制SREBP-1c和激活AMPK途径调节下游脂质生成和脂肪酸氧化相关基因ACC、FAS、SCD-1的表达，从而在HepG2细胞脂肪变性中发挥作用。

6LBLF提取物对脂质相关基因的影响

由图5可知，与空白对照组相比，油酸干预后脂质生成相关基因ACC、FAS、SCD-1、PPARγ、CEBPα、SREBP-1c mRNA表达水平均上调。通过40、60、80 μg/mL的LBLF和198.3 μg/mL奥利司他处理后脂质生成相关基因ACC、FAS、SCD-1、PPARγ、CEBPα、SREBP-1c的mRNA表达水平均下调，这些结果表明LBLF和奥利司他下调HepG2细胞脂质生成过程中关键基因的表达。本课题组前期研究发现，LBLF通过调节高脂肪饮食喂养小鼠的糖脂水平、氧化应激水平和肠道细菌组成降低高脂肥胖模型小鼠的肥胖程度、改善糖脂代谢紊乱症状、降低体内氧化应激水平、增加粪便脂质排泄量及缓解脂肪肝病症。此外，有研究表明黄酮类化合物姜黄素可以通过调控AMPK磷酸化活化以及抑制雷帕霉素靶蛋白的活性实现同等效果，使下游SREBP-1c、PPARγ、CEBPα、ACC、FAS、SCD-1水平下调及CPT1α、PPARα水平上调，从而减轻壬基酚诱导的HepG2细胞脂质变性，这与本研究结果基本一致，说明油酸诱导HepG2细胞脂质生成中的转录因子可能通过调节关键产脂基因的表达诱导脂肪变性，其机制可能是产脂关键酶ACC、FAS、SCD-1表达上调受到其上游转录因子SREBP-1c的调控，通过调控PPARγ、CEBPα、SREBP-1c关键转录因子进而发挥降脂作用。

结论

本研究通过油酸诱导HepG2细胞构建脂肪变性模型，在培养体系中加入不同质量浓度的LBLF探讨LBLF干预调节脂质代谢的作用机制。结果表明，随着LBLF质量浓度的增大，抑制细胞内脂滴聚集的效果明显。在脂质代谢方面，LBLF干预后HepG2细胞的TG、TC和LDL-C水平显著下调，而HDL-C水平则明显上升。通过检测HepG2细胞内脂肪积累的相关酶活性，结果显示，与模型对照组相比，LBLF处理组SOD、GSH和CAT活性均极显著上调，而MDA含量则极显著下调（P＜0.01）。荧光显微镜观察进一步证实，LBLF处理组的HepG2细胞内ROS含量逐渐减弱，这 表明LBLF对于缓解油酸诱导的HepG2细胞氧化应激损伤具有积极作用。通过测定脂质代谢过程中重要转录因子和关键酶的表达水平，发现LBLF可通过调控ACC、FAS、SCD-1、PPARγ、CEBPα、SREBP-1c水平下调及p-AMPK/AMPK水平上调，从而减轻油酸诱导的HepG2细胞脂质代谢紊乱。综上所述，LBLF对HepG2细胞脂质代谢具有显著的调节作用。本研究揭示了LBLF通过某些途径或分子参与脂质代谢的调控，可为进一步深入研究LBLF对脂质代谢的作用机制提供理论依据。

本文《 枸杞叶黄酮对HepG2细胞脂 质代谢的影响及作用机制 》来源于《食品科学》2024年45卷第11期31-40页，作者： 杨超，裴宇芳，孙霞芝，刘霜， 张惠玲，范艳丽 。DOI: 10.7506 /spkx1002-6630-20230904-018 。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信 息。

实习编辑：俞逸岚；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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