PNAS丨尹鑫团队/王麟团队联合解析“准囊膜”戊型肝炎病毒粒子的形成机制

传统意义上，根据病毒衣壳表面囊膜的有无，病毒被大致界定为两类：囊膜病毒或无囊膜病毒。戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus, HEV）自1980年被发现以来，一直被归类于无囊膜病毒范畴之内。然而，最新研究表明，HEV以两种不同病毒粒子形式存在：从肠道中排泄的病毒粒子为“无囊膜”形式，而循环于血液中或分泌至培养上清中的病毒粒子表面则包被有一层脂膜，但该类型病毒粒子不同于传统意义上囊膜病毒，其脂膜表面并不展示任何病毒纤突或抗原蛋白，以此提出了“准囊膜”戊型肝炎病毒粒子的概念【1】。后续研究揭示：由于“准囊膜”与“无囊膜”戊肝病毒粒子构成及形态的不同，它们通过两种不同的方式入侵靶细胞启动感染，在病毒感染过程中可能执行不同使命。然而，“准囊膜病毒粒子是如何形成的？”这一关键科学问题一直悬而未决。

2024年12月 30日，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所尹鑫团队联合北京大学王麟团队在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America上发表题为Palmitoylation-dependent Association with Annexin II Directs Hepatitis E Virus ORF3 Sorting into Vesicles and Quasi-enveloped Virions的研究论文，发现棕榈酰化修饰的HEV ORF3靶向招募宿主蛋白Annexin II (ANXA2)，进而借助细胞骨架运输至细胞多泡体（MVBs）中，最终实现准囊膜病毒粒子的有效释放。

作者首先通过速率区带高速离心法对HEV感染细胞上清中的病毒相关成分进行系统分析，发现感染细胞可释放“准囊膜”病毒粒子（包含衣壳蛋白ORF2C、病毒RNA及ORF3蛋白）与游离抗原（ORF2S）【2】。有意思的是，ORF3蛋白除了存在于“准囊膜”病毒粒子之中，还以非病毒粒子形式存在。进一步研究发现，ORF3蛋白可不依赖于其它病毒蛋白独立分泌于细胞外，提示HEV ORF3具有自分泌功能，“准囊膜”病毒粒子的形成发生于HEV ORF3的自分泌过程中。

为了进一步解析HEV ORF3促进准囊膜病毒粒子形成的机制，作者利用HEV ORF3自分泌模型，通过小RNA干扰实验筛选了参与HEV ORF3分泌的宿主蛋白，最终将目标锁定至膜联蛋白Ⅱ（Annexin Ⅱ, ANXA2）。研究发现，敲低ANXA2不影响HEV在细胞中的复制，但可显著降低HEV ORF3与准囊膜病毒粒子的释放，且ANXA2可被HEV ORF3蛋白特异性招募至准囊膜病毒粒子中，表明ANXA2是介导准囊膜病毒粒子释放的关键蛋白。通过丙氨酸扫描法进行突变，作者发现HEV ORF3中的第18位和21位半胱氨酸对于其与ANXA2相互作用至关重要，而该两个位点是HEV ORF3进行棕榈酰化的核心位点，提示HEV ORF3的棕榈酰化修饰决定其与ANXA2的结合能力。为了进一步证实该结论，作者使用棕榈酰化修饰抑制剂2-BP处理细胞，发现2-BP处理可显著影响HEV ORF3的棕榈酰化修饰，进而减弱了HEV ORF3与ANXA2的相互作用。

HEV ORF3为何需招募ANXA2进行分泌释放？作者通过细胞组分分离实验发现：HEV ORF3主要分布于细胞质膜组分及细胞骨架组分，而在ANXA2敲除细胞中，HEV ORF3仅在细胞质膜组分中被检测到，提示，ANXA2可协助HEV ORF3锚定至细胞骨架组分。丧失与ANXA2结合的HEV ORF3突变体（C18S/C21S）也不能被运输至细胞骨架组分。上述研究结果表明，HEV ORF3通过招募ANXA2锚定至细胞骨架中，从而进入细胞多泡体进行有效释放。

最后，作者利用建立的HEV沙鼠感染模型【3】，验证上述体外细胞的机制研究，研究发现：与野生型毒株相似，HEV（C18S/C21S）突变病毒可在沙鼠肝脏组织中正常复制，也不影响ORF2S的正常分泌，但突变体病毒完全丧失了粪便排毒的能力。此外，ANXA2抑制剂可在感染早期降低感染沙鼠粪便中的病毒载量。综上所述，HEV感染宿主细胞后，HEV ORF3蛋白进行棕榈酰化修饰，从而招募ANXA2蛋白靶向细胞骨架。在此过程中，病毒粒子与ORF3复合体进行装配，进而内陷至细胞多泡体，最终细胞多泡体与细胞膜进行融合，释放“准囊膜”病毒粒子及ORF3蛋白。研究结果丰富了大家对准囊膜病毒粒子释放过程的认知，为进一步精细剖析该过程提供了参考。

研究图片摘要

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所刘杏博士和北京大学基础医学院刘天旭博士为文章的第一作者，中国农业科学院哈尔滨兽医研究所尹鑫研究员和北京大学王麟助理教授为文章的共同通讯作者。哈尔滨兽医研究所汤艳东副研究员、美国儿童医院研究所（The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital）Zongdi Feng教授为本研究开展提供了重要帮助。

文章链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2418751122

参考文献

1 Yin, X., Ambardekar, C., Lu, Y. & Feng, Z. Distinct Entry Mechanisms for Nonenveloped and Quasi-Enveloped Hepatitis E Viruses. J Virol 90, 4232-4242 (2016). https://doi.org/10.1128/JVI.02804-15

2 Yin, X. et al. Origin, antigenicity, and function of a secreted form of ORF2 in hepatitis E virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A 115, 4773-4778 (2018). https://doi.org/10.1073/pnas.1721345115

3 Liu, T. et al. An Immunocompetent Mongolian Gerbil Model for Hepatitis E Virus Genotype 1 Infection. Gastroenterology 167, 750-763 e710 (2024). https://doi.org/10.1053/j.gastro.2024.03.038

本期来源：BioArtMED