质谱技术助力疑难菌诊断——欧洲放线菌致颈部脓肿一例

作者 | 李笛

单位 | 青岛市市立医院

前 言

放线菌为革兰染色阳性无芽孢杆菌，大多数厌氧或微需氧，存在于健康人体的口腔、扁桃体窝、胃肠道及生殖道，是人体的一种条件致病菌[1-2]。

该菌主要侵犯人体的面颈部、胸部、腹部和女性盆腔，病程缓慢呈渐进性，在局部表现为慢性化脓性肉芽肿病灶，向局部扩展并形成瘘管，排出的脓液中有硫磺样颗粒。

国内外文献报道中常见的引起放线菌病的有衣氏放线菌、内氏放线菌、溶齿放线菌等[3-4]，关于欧洲放线菌(Actinomyces europaeus)引起的感染报道较少，最早于1997年在人类中分离出来，它是一种在泌尿生殖系统和胃肠道中发现的共生细菌[5]。

虽然已有外文文献报道其能引起乳腺脓肿及坏死性筋膜炎[6-8]，但在国内分离及引起感染的报道罕见，万方数据库中仅有一篇关于欧洲放线菌所致感染的文献[9]。

案例经过

患者男，26岁，既往有2型糖尿病史，空腹血糖控制不佳，波动于8mmol/L左右。右颈后见一巨大包块，大小约7cm×8cm，就诊时包块完整，伴红肿热痛。

入院后检查血常规白细胞计数11.7×109/L,中性粒细胞计数7.43×109/L，单核细胞计数0.96×109/L，C反应蛋白17.3mg/L,提示有炎症。

血清生化空腹血糖11.7mmol/L,糖化血红蛋白7.5%，γ-谷氨酰转移酶87.47U/L,丙氨酸氨基转移酶147.11U/L，天门冬氨酸氨基转移酶79.68U/L，乳酸脱氢酶305.84，载脂蛋白A11.15g/L,载脂蛋白B1.16g/L,尿酸594.43umol/L，同型半胱氨酸17.20umol/L，亮氨酸胺肽酶80.00U/L,亮氨酸脱氢酶7.70U/L，直接胆红素4.40umol/L,间接胆红素18.10umol/L，提示有血糖高，肝功损伤。

心电图大致正常；右颈后肿物处彩超探查：皮下可见一混合回声包块，范围约6.9*6.7cm，囊性成分内透声差，内可见点状强回声及条索样低回声，周边可探及少许血流信号。入院当晚颈部包块破溃流脓，局部红肿，多处破溃，有脓血溢出（见图1）。

图1 患者颈部包块破溃流脓

随即送分泌物至病理室及微生物室，病理报告为“硫黄颗粒”样，提示可能为放线菌感染[10]。

在微生物室先后进行了四次脓液细菌涂片与培养，脓液直接涂片均可见短小的革兰阳性杆菌，见（图2），该菌生长较为缓慢，将脓液接种于哥伦比亚血平板，35℃，5% CO2条件下培养72h后可见干燥、白色、无溶血环的直径约为1mm菌落（见图3），培养菌落革兰染色显示为革兰阳性杆菌（见图4）。

图2脓液直接涂片革兰染色结果（10×100）

图3 37℃血平板培养72h菌落形态

图4细菌涂片革兰染色结果（10×100）

VITEK2 COMPACT的ANC卡鉴定结果为麦氏放线菌，鉴定率86%，生物编码：736600666000401，因为卡片可鉴定的放线菌不涵盖欧洲放线菌，所以同时采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）鉴定该菌为欧洲放线菌，四次培养鉴定结果一致，分值分别为2.17，2.25，2.18，2.20，根据布鲁克质谱仪说明书与《中国临床微生物质谱应用专家共识》[11-12]，质谱鉴定分值在2分以上鉴定结果到种水平，因此可确定该患者为欧洲放线菌所致的面颈部感染。

通过对患者脓肿进行切开引流，氨苄西林（2g）静脉滴注，同时通过口服二甲双胍缓释片控制血糖，四周后，颈部包块明显缩小，无脓液渗出。患者四周后出院，继续口服青霉素V钾（2~4g/d）四周，出院三个月后随访伤口恢复良好，无复发，血糖控制良好。

案例分析

放线菌的发病机制通常为通过破坏粘膜屏障，导致化脓及随后的脓肿形成，最常见的感染部位为面颈部感染，本病例即为2型糖尿病患者由欧洲放线菌所致的颈部脓肿。

传统的细菌鉴定方法通常是通过观察细菌形态，细菌的生化反应来进行分析鉴定。放线菌生长较慢，传统的鉴定方法很难鉴定放线菌到具体的菌种，随着分子生物学在临床微生物中的应用，使得原来由于鉴定困难而忽视的放线菌病报道越来越多。

本例报道的欧洲放线菌国内相关文献较少，可能与传统鉴定方法导致该菌鉴定失败有关。欧洲放线菌生长缓慢，无典型的菌落形态，常规鉴定方法较难准确鉴定，VITEK2 COMPACT的ANC卡不覆盖欧洲放线菌，所以此病例上机鉴定麦氏放线菌，鉴定率86%，结果不可靠。

通过分子生物学技术如高通量测序、16SrRNA、PCR、MALDT TOF MS技术在微生物鉴定中的应用，使得细菌的鉴定能够从表型特征深入到基因特征，然而前三者价格高昂且过程繁琐，在临床常规使用中就受到了限制[13]，而MALDT TOF MS技术，是依据不同细菌的特异性指纹图谱进行鉴定，该方法具有快速、高通量、操作简单及运行成本低的优点[14]，便于在临床菌种鉴定中常规使用；

但该技术由于菌种库中菌种种类数量有限，对于少见菌和罕见菌鉴定方面有一定的缺陷[15]，需要鉴定分值达到2分以上才能确定具体菌种[11-12]。

本文病例通过MALDT TOF MS技术，多次培养鉴定结果一致且分值均大于2分，均为欧洲放线菌，可确诊患者为欧洲放线菌所致的颈部感染。

由于放线菌属常规无法开展药敏实验，参考《热病》48版推荐的治疗方案，临床上治疗放线菌的药物主要是青霉素和氨苄西林，治疗周期一般三个月以上，因为该患者有糖尿病，通过控制血糖水平且进行伤口清创引流及根据《热病》48版选择合适的药物及疗程后，该患者预后良好。

总 结

放线菌属是厌氧菌，在厌氧或微需氧环境中能够生长，但是由于菌落生长缓慢，往往需要延长培养，血平板上35℃孵育3-7d天后才出现肉眼可见菌落，菌落或粗糙或光滑，形态不定。

镜下一般为革兰阳性杆菌，呈分枝状或细长丝状，有时染色不定。依靠常规培养手段鉴定效果差，通过对本病例诊断的分析，有条件的实验室通过开展MALDT TOF MS 技术，可以大大提高对疑难菌的鉴定，以便更好地指导临床医生合理用药，避免误诊耽误治疗。

专家点评

专家：王玉洁 青岛市市立医院检验科 副主任技师

对于一些疑难菌株，依靠传统的实验方法往往很难明确病原体，通过借助一些分子的实验方法，如本病例中的质谱技术，可以大大提高对疑难菌的鉴定率，明确病原学诊断，更精确更快速指导临床用药。微生物实验室工作人员要有临床思维，不轻易忽略任何可能引起感染的病原体，积极抓住病原体真凶。

参考文献

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[2]Kim J, Wood C, Sandkovsky U, Rokadia H. Actinomyces lymphadenitis. Proc (Bayl Univ Med Cent). 2020;33(3):444-445.

[3]Stabrowski T, Chuard C. Actinomycose [Actinomycosis]. Rev Med Suisse. 2019;15(666):1790-1794.

[4]叶飞,罗梦林.衣氏放线菌合并牙龈卟啉单胞菌皮肤软组织感染1例并文献复习[J].重庆医学,2022,51(15):2588-2590,2595.

【5】Funke G, Alvarez N, Pascual C, et al. Actinomyces europaeus sp. nov., isolated from human clinical specimens. Int J Syst Bacteriol. 1997;47(3):687-692.

【6】Silva WA, Pinheiro AM, Jahns B, Bögli-Stuber K, Droz S, Zimmerli S. Breast abscess due to Actinomyces europaeus. Infection. 2011;39(3):255-258.

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[10张维清,林宇岚,甘龙杰,陈守涛,张文明,杨滨.一株罕见Ihumii放线菌的分离和鉴定[J].国际检验医学杂志,2019,40(4):508-510

[11]中国临床微生物质谱共识专家组．中国临床微生物质谱应用专家共识[J]．中华医院感染学杂志，2016, 26(10): 1-4.

[12]中国临床微生物质谱共识专家组．中国临床微生物质谱应用专家共识(续)[J]．中华医院感染学杂志，2016, 26(11): 5-8.

[13]江苏省医学会检验学分会,江苏省临床检验中心.宏基因组测序技术检测感染性病原体江苏专家共识(2020版)[J].临床检验杂志,2020,38(9):641-645.

[14]李萌,罗美玲.MALDI-TOF MS在临床微生物检验中的应用进展[J].华夏医学,2022,35(3):160-164.

[15]Patel R. MALDI-TOF MS for the diagnosis of infectious diseases. Clin Chem. 2015;61(1):100-111.

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编辑：徐少卿 审校：陈雪礼