清华陈振团队最新综述：微生物合成二元醇已取得重要进展

二元醇是一类极为重要的大宗化学品，已经广泛用于合成聚酯和聚醚多元醇等高性能材料、化妆品、燃料、食品以及制药行业中。以生物质等可再生碳源为底物的生物合成法是一种可持续且极具前景的二元醇生产方法，这种方法可以减少对化石能源的消耗，同时减少二氧化碳排放。
现阶段，生物合成法生产二元醇已经取得了重要进展，比方说生物法合成 1,3-丙二醇、1,3-丁二醇和 1,4-丁二醇已经实现了商业化。不过，利用生物法高效合成其他二元醇还面临着挑战，包括缺乏有效的天然生物合成途径以及工程菌产率低等等。也因此，生物法合成二元醇仍然任重道远。

近日，清华大学陈振团队详细讨论了微生物合成二元醇的最新研究进展，尤其集中在通过开发新代谢途径和代谢工程策略高效生物合成 C2 至 C5 二元醇。在这篇综述文章中，该团队通过设计和构建非天然合成途径生物法合成了一系列非天然二元醇，还以木质纤维素等非传统碳源为底物、通过特定的代谢途径和优化策略合成二元醇，这为二元醇的生物合成开辟了新思路。与此同时，研究团队还讨论了这些生物合成过程向工业应用转化过程中存在的主要挑战和发展前景。

本综述文章的通讯作者是清华大学化学工程系副教授陈振，他的研究方向是开发面向工业应用的合成生物学新方法，包括非天然途径设计、新功能酶的挖掘与改造、原子经济的产品设计工程等，相关技术已成功应用于工业化生产氨基酸及衍生物、生物基二元醇、精细化学品等重要产品。公开资料显示，陈振所在的清华大学应用化学研究所团队从 2000 年前后开始尝试以甘油为原料生产 1,3 - 丙二醇，这是国内外最早实现生物法 1,3 - 丙二醇产业化的课题组之一。
已可利用工程微生物生产特定二元醇
二元醇的种类丰富多样，凭借多功能性和独特的化学特性，其不仅在化学合成领域中不可替代，同时也在日常生活中发挥着重要的作用。
比方说，乙二醇（EG）由于低冰点和高沸点的特征成为制造防冻剂的首选，尤其在汽车冷却系统中应用广泛；无毒二元醇包括 1,2-丙二醇 （1,2-PDO）、1,3-丙二醇 （1,3-PDO）和 1,3-丁二醇（1,3-BDO）在化妆品和食品工业中可用作溶剂、保湿剂和防腐剂；乙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇（1，4- BDO）等多种 1，n-二元醇作为关键单体在合成聚酯和聚氨酯等聚合物材料方面具有重要意义；而 1,5-戊二醇（1,5-PDO）凭借较长的碳链在制造高性能改性塑料方面更具价值。

现阶段，以可再生碳源为底物的微生物发酵法是比化学合成法更具有优势的二元醇生产方式。值得一提的是，代谢工程和合成生物学技术的快速发展，为生物合成二元醇提供了更多新工具。通过改造和优化微生物代谢途径，研究人员们已经可以利用工程微生物高效生产一些特定的二元醇。
第一个大规模商业化的二元醇生物合成工艺由杜邦公司在 21 世纪初开发，这是一种利用重组大肠杆菌合成 1,3-丙二醇的技术。公开资料显示，与石油路线相比，这一技术使原料成本下降了 37%， 全生命周期二氧化碳排放减少 63%，过程能耗减少了 30%。
后续，美国 Genomatica 公司实现了生物法合成 1,4-丁二醇和 1,3-丁二醇的商业化，这证明了生物法合成二元醇的技术和经济可行性，也为未来更多种类二元醇的绿色生物制造提供了更多参考。
微生物合成乙二醇和丙二醇
乙二醇是最简单的二元醇，可用于溶剂、防冻剂以及 PETE 等，这是化纤产业的基础原料之一。合成这种化合物极具前景的方法是直接从糖转化为乙二醇的绿色生物合成过程。目前，有三条主要的生物合成路径以 D-木糖为底物生产乙二醇，分别为，Dahms 途径、木酮糖-1-磷酸（X1P） 途径和核酮糖-1-磷酸（R1P）途径。
这三条途径具有相同的理论得率，但各个途径的效率及实现难度具有显著的差异。其中，Dahms 途径是最早也是最容易实现的途径，研究人员采取了多种策略提高产量。通过过表达 NADPH 依赖的醇脱氢酶基因 yqhD 并调节 xylB 表达，成功构建的大肠杆菌能积累 108.18 g/L 的乙二醇 ，据悉这也是目前报道乙二醇的最高产量。而 X1P 和 R1P 途径的能量效率低于 Dahms 途径，但这两条途径具有更广的适用性。
另一种二元醇即 1,2- 丙二醇也称为丙二醇，可用于生产聚酯树脂、防冻剂、液体洗涤剂、生物燃料、化妆品、食品等。1,2- 丙二醇的生物合成途径可以分为三种：脱氧己糖途径、丙酮醛途径和乳酸途径。这些途径涉及不同的中间体和酶，且都只有在厌氧条件下才有效。

脱氧己糖途径仅能利用特定的糖类底物脱氧己糖，比如 L-岩藻糖和 L-鼠李糖，这些底物成本较高，难以大规模应用于商业化生产；丙酮醛途径将 DHAP 通过 mgsA 编码的丙酮醛合酶转化为关键中间体丙酮醛， 随后通过不同的醇脱氢酶进一步将其转化为乳醛或丙酮醇并最终还原为 1,2- 丙二醇。这一途径可使用多种糖类底物，有利于降低成本，但是需要解决中间代谢物丙酮醛的细胞毒性等问题；乳酸衍生途径可避免有毒中间体丙酮醛的产生，并能利用多种乳酸脱氢酶产生具有特定立体构型的 1,2- 丙二醇。
3 类二元醇已商业化，3 类二元醇还处于探索阶段
上文提到，生物法合成 1,3-丙二醇、1,3-丁二醇和 1,4-丁二醇已实现了商业化。其中，1,3-丙二醇是一种重要的有机溶剂，可应用于化妆品、树脂和制药等工业领域，同时也是制备高性能材料的重要原材料或中间体。1,3-丙二醇作为关键单体构成的高性能聚酯材料——聚对苯二甲酸丙二 醇酯（PTT）凭借优良的柔软性、弹性和耐污性等特点，被称为“聚酯之王”。
自然界中的微生物 K. pneumoniae、C. butyricum 和 C. pasteurianum 已被广泛应用于生产 1,3-丙二醇。这些微生物在厌氧或微氧条件下将甘油转化为 1,3-丙二醇，这一过程包括简单的两步酶促反应。为了增加产量，研究人员通过对非天然的底盘细胞进行系统工程改造，使其能够高效利用甘油生产 1,3-丙二醇；除甘油之外，目前最成功的案例是杜邦开发的重组 1,3-PDO 生物合成线路，以大肠杆菌为底盘细胞，以葡萄糖为底物，最终产量达到 135 g/L。
还有团队优化谷氨酸棒杆菌中特有的甘油合成模块并整合外源的 1,3-丙二醇合成模块高产化合物，以葡萄糖为底物，重组菌株的产量达到 110.4 g/L ，以葡萄糖和木糖作为共底物产量为 98.2 g/L，这一技术目前已经在国内实现了商业化；其他途径还包括将天然 1,3-丙二醇合成途径表达到异源宿主，提出替代途径。
1,3-丁二醇是一种具有重要工业价值的 C4 二元醇，不仅在化妆品行业作为保湿剂被广泛应用， 还是塑化剂、树脂和合成橡胶等行业的关键原料。在生物合成领域，Kataoka 等人首次报道了一 种基于 3-羟基丁酰辅酶 A 的生物合成路径，后续有团队通过引入突变和过表达等方式增强醛脱氢酶的活性以及提升 NADPH 供应等等方式提高得率，还有团队提出结合 3-HB 还原途径和非氧化糖酵解途径。Genomatica 公司研发了一种以葡萄糖为原料生产 1，3-丁二醇的工艺，并自 2017 年起开始向市场销售。

1,4-丁二醇是另外一种大宗的化工原料，广泛用于合成聚酯、氨纶和四氢呋喃等重要材料和化工产品。Genomatica 公司通过在大肠杆菌中建立非天然的 1,4-丁二醇合成途径，并实现其商业化生产。其选择的合成途径起始于 TCA 循环中的琥珀酰辅酶 A，通过来源于 Porphyromonas gingivalis 的琥珀酸半醛脱氢酶 （SucD） 和 4-HB 脱氢酶 （4HBd） 将其还原为 4- HB，并进一步在多种酶催化下生成 1,4-丁二醇。随后，对代谢途径和底盘细胞进行全方位优化和改造，最终工程化菌株以葡萄糖为底物可生产 125 g/L 的 1,4-丁二醇。除了以葡萄糖为底物，研究人员还探索了多种将木质纤维素衍生糖转化为 1,4-丁二醇的途径。
该公司已授权多家公司生产生物基 1,4-丁二醇，包括德国巴斯夫公司、意大利 Novamont 公司以及 Qore 公司等，产能超 10 万吨/年。
此外，论文中还提到了 2,3-丁二醇、1,2-丁二醇以及 1,5-戊二醇的生物合成方法。2,3-丁二醇是唯一能够由多种微生物天然合成的 C4 二元醇，可直接作为燃料添加剂和防冻剂使用、亦或生产大宗化学品等等。领域内利用酿酒酵母和谷氨酸棒杆菌作为底盘细胞，酿酒酵母作为底盘产量达到了 178 g/L，这是迄今为止报道的最高产量；1,2-丁二醇在自然界中尚未发现其天然的生物合成途径，有研究人员首次构建了以葡萄糖为底物的非天然合成途径；1,5-戊二醇是最重要的 C5 二元醇之一，同样不存在天然生物合成途径，领域内提出了一种基于戊二胺的更高效生物合成途径。
还有多个问题有待解决
近年来，二元醇的生物合成技术已经取得了重要进展，一方面使得生产天然二元醇成为可能，另一方面还开辟了生产非天然二元醇的新路径。不过，论文中也明确指出，虽然已有特定生物基二元醇实现了商业化生产，但是绝大多数其他二元醇的生物合成以及规模化生产还面临多个挑战。
比方说，目前，通过人工途径合成非天然二元醇的工作还处于概念验证阶段，通过自然筛选的天然酶通常难以高效催化所需的新反应，从而导致途径效率低以及有毒中间体的积累，限制目标产物的高效合成。研究人员表示，需要挖掘新酶并通过蛋白质工程提高活性，结合模块化工程、途径组合优化、基于生物传感器的高通量筛选技术、系统代谢工程以及基因工程等。
另一个挑战是如何实现工程化细胞发酵以及提取过程的工业放大，这是实现二元醇大规模应用必须解决的问题。通常由于不同体积发酵罐中的传质和传热效果的改变以及局部剪切力、温度、pH 等条件的变化，细胞工厂在放大过程中常常出现性能衰退、细胞裂解、杂菌以及噬菌体侵染等现象，这会极大影响发酵过程的放大。
论文中提到，通过构建人工代谢途径与细胞生长、存活、以及底物利用相 合的人工基因回路是提高细胞鲁棒性的有效策略；也可以在菌株开发过程中利用模拟工业发酵环境的尺度缩减模型（scale-down）进行发酵测试，尽早发现工程菌株可能存在的问题；其他策略还包括要利用基于极端微生物的新型工业底盘，引入基于微生物共生体的新型生物生产工艺等等。
参考链接：
1.https://synbioj.cip.com.cn/CN/10.12211/2096-8280.2024-014
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