江大周景文团队实现叶黄素的高效生物合成

叶黄素是一种由植物和藻类自然合成的四萜类类胡萝卜素。它是人眼视网膜黄斑区域的主要色素，具有显著的营养价值。目前的叶黄素合成方法中，植物提取法存在产量低、生长周期长等缺点。相比之下，利用微生物合成叶黄素是一种重要的绿色和可持续的生产方法，可以替代传统的植物提取技术。

叶黄素生物合成途径主要包括原核生物和叶绿体中的MEP途径和大多数真核生物中的MVA途径。其中，酵母中叶黄素的合成途径包括三个代谢模块:乙酰辅酶 a 通过 MVA 途径合成番茄红素，番茄红素通过 β-环化和 ε-环化合成 α-胡萝卜素，以及 α-胡萝卜素通过 β-羟基化和 ε-羟基化合成叶黄素。

▲图 | 解脂耶⽒酵⺟中叶⻩素从头合成的⽰意图

在上述三个代谢模块中，番茄红素已实现了在各种微生物宿主中的高效合成。然而，由于缺乏一种能够有效催化番茄红素不对称环化成 α-胡萝卜素的酶，第二代谢模块 α-胡萝卜素的生物合成是叶黄素生物合成的主要瓶颈之一。此外，在第三个代谢模块中，α-胡萝卜素被两种 P450 单加氧酶通过 β-羟基化和 ε-羟基化以及细胞色素 P450 还原酶(CPR)转化为叶黄素。对于工程菌的选择上，解脂耶氏菌通常被认为是安全的(GRAS)，由于其丰富的乙酰辅酶 a 含量和高脂质积累潜力，被认为在生产脂溶性化合物方面具有重要的潜力。

基于此前的研究，来自江南大学生物工程学院的周景文团队开发了一种高效合成叶黄素的微生物合成策略，首次在解脂耶氏菌中成功合成 α-胡萝卜素和叶黄素，并且叶黄素获得了目前报道的最高滴度 675.40 mg/L。这项成果已经以“De Novo Biosynthesis of Lutein in Yarrowia lipolytica”为题发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。

对于第一个代谢模块，研究人员筛选了不同来源的番茄红素合成酶，通过增强 MVA 途径，实现番茄红素的高产。首先通过 CarB 和 CarRPE78K 的共表达得到番茄红素产量为 119.05 mg/L 的工程菌 F6，然后将 GGPPyl、GGPPsa 和 GGPPxd 基因整合到菌株 F6 的 A3 位点，获得了番茄红素产量为 422.55 mg/L 的工程菌 F9，最后将 tHMG1、IDI1、ERG12 和 ERG20 基因同时整合到菌株 F9 的 zeta 位点，获得滴度最高（626.00 mg/L）的工程菌 F12。

在实现番茄红素的高产后，接下来就进入第二个代谢模块——α-胡萝卜素的高效合成。在工程菌 F12 的基础上，引入 OluLCY 获得了能产生 α-胡萝卜素 A4，但其产量不高，这是由于细胞内的区隔化屏障，限制了酶和底物之间的相互作用。为了解决这个问题，研究人员将 OluLCY 同时定位于 ER 和 LD 上获得了 A8，与对照菌株相比，其 α-胡萝卜素的转化率得到了改善。

叶黄素是 α-胡萝卜素的衍生物，在细胞色素 P450 酶和相应的 CPR 催化作用下，由 α-胡萝卜素的ε-羟基化和β-羟基化产生。而目前微生物中的 P450 酶活性是高效合成叶黄素的瓶颈之一。因此，针对这个问题研究人员通过对叶黄素合成所必须羟化酶 LUT1 和 LUT5 进行截短，并和 AtCPR1（P450 还原酶 Ⅰ）同时定位于 ER 和 LD 位点，从而提高的叶黄素产量。

由于类胡萝卜素不稳定，暴露于光和氧下容易氧化，因此有必要提高 α-胡萝卜素和叶黄素的抗氧化性能和稳定性。因此，研究人员在流加培养中加入抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）促进叶黄素的积累，在 5 升的反应器中获得 675.40 mg/L 的叶黄素滴度。

综上所述，本研究首次构建了脂质体叶黄素生物合成途径，通过增强前体代谢通量、优化 OluLCY 表达、提高羟化酶活性、添加抗氧化剂 BHT 实现叶黄素的高效合成。测定到的最大叶黄素滴度为 675.40 mg/L，是目前报道的最高叶黄素滴度。本研究结果为在解脂耶氏菌中微生物合成许多具有商业意义的类胡萝卜素，加速 α-胡萝卜素和叶黄素的工业化生产提供了参考。

本文的通讯作者周景文是来自江南大学生物工程学院教授、博士生导师，未来食品科学中心副主任。曾先后在哈佛大学和康奈尔大学从事博士后和访问学者研究。主要从事微生物代谢工程和合成生物学强化微生物合成植物天然产物相关研究。

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