《食品科学》：江南大学张晓娟教授等：不同β-葡萄糖苷酶活性乳酸菌发酵豆乳特性分析

豆乳中富含大豆异黄酮，已发现的大豆异黄酮有12 种，其中3 种为游离型苷元形式（2%～3%），剩余为结合型糖苷形式（97%～98%），生物利用度极低，此外，豆乳中常伴有豆腥味。乳酸菌发酵既能改善植物基饮料的风味，提高营养价值，也能延长货架期，增强保健作用。β-葡萄糖苷酶普遍被乳酸菌表达，是这类黄酮糖苷转化的主要催化酶。不同乳酸菌的酶活性存在差异，而不同菌株表达的β-葡萄糖苷酶对大豆苷、黄豆苷、染料木苷的底物偏好性仍然缺乏相关研究。

江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心张晓娟*和江南大学生物工程学院罗悦，刘瑞山等 研究以豆乳为发酵基质，对比不同β-糖苷酶活性的乳酸菌发酵对豆乳总酚、总黄酮、大豆异黄酮含量和抗氧化活性的影响，并结合活菌数、有机酸、风味物质组成、感官等指标筛选出最适宜豆乳发酵的乳酸菌，旨在开发针对豆乳原料发酵的适宜菌株，为工业生产兼具营养功能和风味特性的益生菌发酵豆乳饮品提供理论依据。同时，本研究菌株酶活性评价、豆乳发酵性 能分析和特征成分解析为类似植物性原料的生物加工工艺开发提供可借鉴的流程。

01

不同乳酸菌在MRS培养基中的性能评价

课题组前期从不同食品来源中分离筛选得到多种乳杆菌，优选了10 株性能较好的乳杆菌进行后续研究，在MRS培养基中的发酵性能见图1。10 株乳酸菌在MRS培养基中生长20 h后OD 600 nm 均可达到7.00以上，生长状况较好，其中LPL051的生长性能最佳，其OD600 nm可高达9.94，而STH041生长量相对较低，其OD600 nm为7.33；并且在所有测试菌株中植物乳杆菌普遍拥有相对较高的生长量。随着菌体的生长繁殖，还原糖被利用有机酸被积累，pH值下降。10 株测试菌株在MRS培养基中生长20 h后还原糖消耗量均在9.0 g/L以上，总酸均在1.0 g/100 mL以上，pH值均下降至4.0以下，其中LHE027对还原糖消耗量较低为9.43 g/L，产酸也较低为1.20 g/100 mL，其余菌株均无显著差异。

如图1D所示，所有测试菌株均表现出β-葡萄糖苷酶活性且表现出菌株的差异性，测试菌株的酶活在0.20～0.35 U/mL之间，其中以LPL051酶活性最高为0.33 U/mL，而单位菌体酶活性以LHE027最高为0.039 U/mL；测试菌株的β-葡萄糖苷酶活性与菌株生长量在一定程度上表现出正相关。

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不同乳酸菌在豆乳中的发酵性能评价

2.1发酵豆乳中的活菌数

如图2A所示，豆乳发酵24 h后乳酸菌活菌数均增加至7.3～8.5（lg（CFU/mL）），且不同菌株间表现出明显差异，其中LPL121发酵豆乳活菌数最高为8.48（lg（CFU/mL）），LPE029活菌数最低为7.32（lg（CFU/mL））。这说明测试的乳酸菌可利用豆乳基质中营养物质进行增殖，并在发酵结束后保持较高的活菌数。

2.2 不同乳酸菌发酵对豆乳的总酸、pH值和还原糖的影响

由图2B可知，发酵豆乳的pH值显著下降，这是由于发酵过程中产生有机酸，例如乳酸、乙酸，导致pH值下降。不同乳酸菌发酵豆乳的总酸含量与pH值呈相反趋势，即发酵后总酸含量显著增加（P＜0.05），由0.12 g/100 mL增加至0.40～0.52 g/100 mL，其中含量最高的为LPL121发酵豆乳，达到0.52 g/100 mL。由图2C可知，不同乳酸菌发酵豆乳的还原糖含量均显著下降，由0.56 g/L下降至0.40～0.25 g/L。其下降是因为乳酸菌利用豆乳中的糖类进行生长和发酵。这表明乳酸菌利用豆乳中的糖分生长并产生有机酸，且菌株对豆乳基质具有良好的适应性。

2.3不同乳酸菌发酵对豆乳的有机酸含量的影响

如图2D所示，原豆乳中主要有机酸是柠檬酸（0.46 g/L）和琥珀酸（0.12 g/L）。相比于发酵前，发酵后产生了大量乳酸（3.47～4.58 g/L），此外，草酸、琥珀酸含量均显著增加（P＜0.05）。各菌株都有一定量的乙酸（0.39～0.59 g/L）积累，表明这些菌株除了通过糖酵解途径生成丙酮酸，进而转化为乳酸以外，也存在依赖于HMP途径的异型乳酸发酵途径。而柠檬酸含量降低了33.91%～49.79%。乳酸菌可以用其不完全的三羧酸循环利用柠檬酸产生能量和生长。除LHE027发酵豆乳外，丙酮酸含量也均有所增加，而豆乳发酵前后奎宁酸、苹果酸和莽草酸的变化趋势在各菌株间并不一致，体现出菌株水平的代谢性能差异。相比于原豆乳，发酵使总有机酸质量浓度增加了3.94 g/L以上，其中LPL121积累的有机酸最多。

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不同乳酸菌发酵对豆乳总酚、总黄酮及体外抗氧化性的影响

如图3A所示，相比于发酵前，发酵使豆乳总酚含量显著增加77.47（10.38%）～287.84 mg/L（38.55%），其中以LPL044最高，为1 034.33 mg/L；除LPE029发酵豆乳外，其余样品中总黄酮含量均显著增加（2.80%～52.57%）。乳酸菌发酵后总酚含量的增加可能是由于乳酸菌产生的酶可以破坏酚类与其他取代基之间的键合作用，从而从植物细胞壁中释放可溶性共轭或不溶性结合酚类化合物，而总黄酮增加可能是由于复杂的多酚在发酵过程中被乳酸菌产生的酶分解为简单的黄酮醇化合物。

如图3 B所示，除STH041外，经乳酸菌发酵后的豆乳DPPH自由基清除率，均显著升高（增加了 3.32 % ～ 27.50 % ）；除 LPL043 发酵未对 ABTS 阳离子 自由基清除活性产生影响外，其余经乳酸菌发酵后的 豆乳 ABTS 阳离子自由基清除率均显著上升（增加了 7.04 % ～ 23.54 % ）。 研究表明大豆中总酚、黄酮是发挥抗氧化活 性的主要成分。因此本研究中总多酚和总黄酮含量的 增加，利于豆乳抗氧化能力的增强。

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发酵豆乳的大豆异黄酮含量变化

如图3C所示，原豆乳中主要含大豆苷、黄豆苷和染料木苷，质量浓度分别为 69.86、2.61、105.02 mg/L，相应苷元形式的大豆异黄酮含量较少，分别为3.82、0.15、5.21 mg/L。豆乳经乳酸菌发酵后3 种糖苷型大豆异黄酮含量均有不同程度下降，苷元型大豆异黄酮含量均显著升高。其中LPL043发酵豆乳中的大豆苷和染料木苷下降最为明显，分别下降了25.61%和22.48%，而黄豆苷则以LPL013发酵豆乳中下降最多，为76.70%；大豆苷元质量浓度增加至5.65～17.61 mg/L，黄豆素质量浓度增加至 0.21 ～ 0.32 m g / L ，染料木素质量浓度增加至9.76～28.70 mg/L。

各菌株发酵豆乳在上述黄酮苷和苷元的含量上存在一定差异，体现了不同来源的菌株对底物存在一定的偏好性。其中LPL042对黄豆苷具有更高的转化选择性；而前期β-葡萄糖苷酶活性最高的LPL044和LPL051对大豆苷和染料木苷转化具有高的转化选择性；LPL241则对各底物都具有相对较好的转化效率，普适性较强。

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发酵豆乳的挥发性风味成分分析

如图4A所示，在原豆乳和乳酸菌发酵豆乳中共检出66 种挥发性化合物，醇类22 种、酸类7 种、酯类4 种、酮类9 种、醛类15 种、呋喃类4 种、酚类4 种、硫化物1 种。

如图4B所示，原豆乳和发酵豆乳的挥发性物质组成具有明显差异，STH041、LPL051、LPL241、LPL043、LPL044和LPE029发酵豆乳挥发性物质组成相近，与LPL013、LPL121、LPL042、LHE027间均存在显著差异。如图4C所示，原豆乳中的挥发性物质主要为醇类、酯类和醛类，豆乳经乳酸菌发酵后挥发性物质总含量均显著增加，醇类、酸类和酮类含量增加，醛类和酯类因菌株的代谢差异呈现不同的变化趋势，LPL013、LPL042、LHE027发酵豆乳中的醛类物质略有增加，其余菌株发酵的豆乳中均显著降低。

在新产生或含量增加的醇类物质中，正己醇具有淡嫩叶香气，1-辛烯-3-醇具有蘑菇、薰衣草、玫瑰和干草香气，正庚醇具有油脂气息，异戊醇具有苹果白兰地香气、苯甲醇略带香气、苯乙醇具有清甜的玫瑰香，这些醇类赋予乳酸菌发酵豆乳鲜香醇厚的特征香气。在乳酸菌进行糖、氨基酸、甲基酮等的物质代谢时，可由相应的醛通过脱氢酶还原形成某些醇。乳酸菌发酵使酸类物质总量增加，增加的主要为乙酸和正己酸。乙酸由乳酸菌异型乳酸发酵途径产生，正己酸可由乳酸菌经乙酸多步碳链延伸反应合成，但其阈值很高，分别为22 000 μg/L和2 517 μg/L，对发酵豆乳整体香气贡献不大。酮类是氧化反应的最终产物，而乳酸菌的加入促进了氧化反应发生。在新产生或含量增大的酮类物质中2-庚酮有类似梨的水果香味，3-羟基-2-丁酮呈奶油和脂肪香气，2-壬酮呈水果、花、油脂和药草似香气，它们均仅出现在发酵豆乳中，是发酵特征香气物质。豆乳中的醛类在乳酸菌发酵后可能被还原成醇或氧化为酸。正己醛和壬醛与豆腥味特征具有正相关关系，而它们均在发酵后均显著降低；苯甲醛、2,4-癸二烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛则对豆浆的特有风味有香气贡献。3-羟基-2-丁酮具有奶油香气，增加了发酵豆乳醇香的特征。

对比各菌株，LPL013和LPL121的风味化合物结构与其他乳酸菌差异较大（如乙醇、正庚醇、甲酸辛酯、2-壬酮、2-戊酮、苯甲醛），PCA结果也体现出这两株菌发酵的样品与大多数样品的差异较大。上述结果体现了风味化合物组成也同样具有一定的菌株特异性。

06

发酵豆乳的感官评价

如图5所示，在外观上，豆乳经乳酸菌发酵后整体发生显著变化，发酵豆乳颜色除LPL044和LPL051外，均比原豆乳略黄一些，光泽感较发酵前好；发酵后乳清均有不同程度的析出，其中LPL044和LPL051发酵豆乳较其他样品而言乳清析出最少，同时也表现出较好的均匀性；豆乳发酵后黏稠性显著增加，其中LPL044、LPL051和LPE029发酵豆乳表现出较高的黏稠性。在香气和滋味上，发酵豆乳较原豆乳整体上增加了酸味、发酵味和奶香，降低了甜味和豆腥味，个别样品则因菌株的发酵特性表现出馊味、苦味和黄油味。其中LPL044和LPL051发酵豆乳的豆香味保留度最高，这与豆乳特征香气物质2,4-癸二烯醛、反式-2-己烯醛、反式-2-辛烯醛等的含量显著增加相关；LPL013和LPL121发酵豆乳表现出最强的酸味和最低的甜味，与上述的糖耗和产酸结果较一致；LPL042、LPL044、LPL051、STH041和LPL241发酵豆乳均有淡淡的奶香，这是因为乳酸菌发酵后产生了奶香味物质3-羟基-2-丁酮；除LHE027、LPL013和LPL042外，其余发酵豆乳样品几乎没有豆腥味，这与发酵豆乳中豆腥味物质正己醛、壬醛和2-戊基呋喃的含量显著降低相关。在口感方面，发酵显著增加了豆乳的醇厚感，带来了少量的刺激感和涩的口感，其中LPL044和LPL051醇厚感较强，细腻度最好柔和度较好，刺激感较弱且无涩味。研究表明，β-葡萄糖苷酶有利于香气前体物质的释放，促进其进一步转化为香气活性物质，赋予食品更高的感官香气质量。LPL044和LPL051表现出最高的β-葡萄糖苷酶活性，如表2所示，发酵的豆乳具有更高的香气质量，滋味协调，口感醇厚细腻，和其他样品区分明显，表现出最高的整体愉悦度。总体来说，乳酸菌发酵在一定程度上改善了豆乳的外观、香气、滋味和口感，保留了豆香味的同时有效降低了豆腥味，并产生了独特的发酵风味，使产品更受人们喜爱，且高β-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌更有利于提高发酵豆乳的品质。

结论

所有测试菌株发酵豆乳后活菌数均增加至7.3（lg（CFU/mL）），其中以植物乳杆菌活菌数普遍较高，表明豆乳是适宜乳酸菌生长的基质。乳酸菌发酵不仅显著积累了乳酸、乙酸等有机酸，还较原豆乳产生含量和种类更多的挥发性物质。保留了豆香味物质、增加了具有奶油香气特征的3-羟基-2-丁酮，同时大多数菌株发酵后降低了豆腥味物质正己醛、壬醛和2-戊基呋喃的含量。感官评价结果表明，乳酸菌发酵显著改变了豆乳的外观、香气、滋味和口感，LPL044的总体感官品质最好，LPL051次之。β-葡萄糖苷酶活性较高的乳酸菌发酵后总酚和总黄酮含量相应增加，大豆异黄酮糖苷相应减少而对应的苷元增加，抗氧化活性也因此提高。不同黄酮糖苷转化程度的差异，也体现了黄酮糖苷水解能力方面的菌株特异性，并且不同来源菌株也存在一定的底物偏好性。LPL044和LPL051具有较高的β-葡萄糖苷酶活性，发酵豆乳具有较高的总酚总黄酮含量、较高的异黄酮转化能力以及较高的抗氧化活性，具有更大的研究和开发价值。同时，研究发现的酶活性、代谢物积累、挥发性成分结构等方面的菌株差异，也为相关原料的生物加工菌株开发提供可借鉴思路。

本文《不同β-葡萄糖苷酶活性乳酸菌发酵豆乳特性分析》来源于《食品科学》2023年44卷第20期155-164页，作者：罗悦, 刘瑞山, 王志远, 等。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221108-079。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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