Nature：王凌华团队等通过单细胞和空间转录组揭示肺腺癌最早的细胞起源

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

肺癌是全世界癌症死亡率最高的恶性肿瘤之一， 其中肺腺癌（Lung adenocarcinoma, LUAD）为最常见的组织学类型。虽然近年来早期检测手段的进步使得越来越多的肺腺癌患者能够得到早期诊断，但现有的治疗手段的预后效果仍不理想。另一方面，近年来针对肺癌，尤其是肺腺癌的前沿研究存在局限性，如样本数量有限，又如单细胞测序规模相对较小，导致可供分析的上皮细胞数量有限。这些现状突显了对早期肺腺癌进行系统性深入研究的紧迫性。
深入理解早期肺腺癌发生发展背后的细胞机制对于寻找新的潜在治疗靶点和制定有效的早期干预策略至关重要。区域癌化（field cancerization）被认为是一个能够解释肺腺癌起源发生的有力模型。模型认为，即使是病理组织学上未见典型癌变特征的区域，其细胞也可能已经存在基因组，转录组，甚至表观遗传组等分子水平的改变。这些区域可能毗邻肿瘤，或随着时间的推移最终发展成肿瘤。癌化的诱因包括外部因素（如吸烟，紫外线，饮酒等）和细胞自身的因素（如基因突变，染色体变异等）。
区域癌化模型为我们理解癌症易感因素与癌前病变，以及肿瘤发生提供了理论基础。因此，对于未经治疗干预的早期肺腺癌病人进行以肿瘤为中心的多点，梯度取样，综合利用单细胞测序和空间转录组测序等多平台数据系统性地研究细胞谱系状态和分子特征，以及肿瘤微环境的改变，将有助于加深对肺腺癌发生早期的细胞动态过程的理解，揭示肺腺癌发生的生物学机制，帮助发现新的潜在的治疗靶点，并为肺腺癌的早期干预和新型疗法的开发提供最具前沿性和创新性的依据。
2024年2月28日，德克萨斯大学MD安德森癌症中心王凌华教授和Humam Kadara教授团队合作，在Nature期刊发表了题为：An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma 的研究论文。
该研究在早期肺腺癌组织和癌旁区域发现了一群携带KRAS致癌基因突变的，KRT8表达阳性的肺泡中间态细胞（KRT8+ alveolar intermediate cells，KACs）。通过和Jichao Chen教授合作，研究团队在基因工程小鼠模型中对肺泡上皮细胞进行了谱系标记和追踪，并证实了KACs最终可转化为肺腺癌细胞。
这项研究不仅为开发针对早期肺腺癌的检测和预防策略提供了新的启示，也为推动在最早阶段检测甚至阻断肺腺癌的发展开辟了新的研究方向。

在这项研究中，研究团队收集了来自16例肺腺癌患者的共63个组织样本，包括16个肺腺癌样本和47个非肿瘤样本（在距离肿瘤三个不同的空间位置梯度取样）。研究团队对全部样本进行了单细胞RNA测序，并对16个腺癌样本进行了全外显子组测序， 并获取了229038 个高质量的正常上皮单细胞的转录组数据以及17064个肿瘤细胞的转录组数据。
这项研究工作是迄今为止关于早期未经治疗干预的肺腺癌在上皮细胞规模和整合数据类型上最大和最全面的单细胞研究。研究团队首先构建了正常上皮的单细胞图谱，然后对鉴定出的癌细胞进行了系统的生物信息学数据分析。分析不仅揭示了早期肺腺癌中肿瘤细胞的显著异质性。更重要地是，该研究发现KRAS突变的早期肺腺癌肿瘤细胞在转录组上表现出独特的转录特征，与来自不含KRAS突变病人的肿瘤细胞有显著区别。
研究团队进一步深入细致地分析了肿瘤细胞，特别是带有KRAS突变的肿瘤细胞与正常上皮细胞之间的关系。对肺泡细胞群和肿瘤细胞进行的拟时间轨迹分析结果显示拟时间轨迹以2型肺泡细胞为起点，一条路径通向1型肺泡细胞， 而另外一条路通向肺腺癌肿瘤细胞。有意思的是，两条路径共享一个中间状态的细胞群，这群细胞同时具有2型肺泡细胞特征和1型肺泡细胞的基因表达特征。2型肺泡细胞（alveolar type 2，AT2）是一种具有合成分泌肺泡细胞表面活性物的细胞，现在的主流观点认为，肺部组织中存在部分具有干细胞特性的2型肺泡细胞，当负责气体交换的1型肺泡细胞（alveolar type 1，AT1）受损时，这部分2型肺泡细胞将分化并补充受损的1型肺泡细胞。拟时间分析结果的的一条路径与此吻合。更重要的是，研究者发现肺泡中间态细胞中一个亚群在肿瘤样本中显著富集，而且该亚群的细胞去分化水平显著升高，提示了这群细胞与肿瘤细胞的密切关系。由于KRT8基因高表达是这群细胞的显著特征之一，研究者将其命名为KACs（KRT8+ alveolar intermediate cells）。
为了进一步了解KACs的重要表型和特征，研究者首先使用多种独立定量技术刻画了肿瘤样本中KACs的特征，通过对多个肿瘤样本进行空间转录组测序（Visium spatial transcriptomics，10X）和数字空间图谱扫描（Digital spatial profiling），他们发现KACs的特征基因在mRNA水平和蛋白质水平不仅在肿瘤细胞中升高，有趣的是在肿瘤周围的毗邻组织中也升高，这一发现支持了他们的假设：KACs可能作为一种“前体中间态细胞”，参与早期肺腺癌的发生和发展。基于此，研究者在大量的独立数据集中进行了验证性分析。首先，他们利用TCGA肺腺癌数据集，发现在肺腺癌样本中KACs信号明显高于来自同一病人的配对癌旁样本。其次，在一组包含15个配对的正常肺组织，癌前病变组织，以及侵袭性肺腺癌组织的数据中，他们发现KACs的信号从正常肺组织到肺腺癌癌前病变组织再到早期肺腺癌组织的渐进性增强。另外，他们还发现KACs信号与病人较差的生存预后显著相关。这些结果进一步支持了研究者的假设。相关结果还显示相比不含KRAS突变的肺腺癌样本，KACs在KRAS突变型肺腺癌呈现出更高的表达水平，揭示了KAC和KRAS突变型肺腺癌之间的密切关系。
以此为基础，研究人员使用基因工程小鼠模型对一系列关于KACs的科学问题进行了系统探索。他们首先在一种能更准确模拟人体KRAS突变的肺腺癌发生过程的小鼠模型中进行了实验研究。该模型在烟草致癌物（Nicotine-derived nitrosamine ketone， NNK）暴露后能够适时地观察到诱导性Kras突变型肺部肿瘤的发生。研究人员在不同时间点采集了对照和处理组样本并进行了单细胞RNA测序分析。通过对单细胞RNA测序数据的分析证实了小鼠中存在表达特征与KACs相匹配的细胞类群，研究者称之为小鼠KACs。通过对比在不同取样时间点的单细胞RNA测序数据，他们发现小鼠KACs的出现在Kras突变型肿瘤出现之前。此外，研究者还对来自小鼠模型的肺癌样本进行了空间转录组测序分析。空间转录组测序数据也呈现出和人肺腺癌样本的空间转录组数据相似的特征，即小鼠肿瘤组织和肿瘤周围邻近组织中存在高水平的KACs特征基因的表达。
基于这些结果，研究者提出并进一步解答了两个关键的科学问题：小鼠KACs来源于何种细胞？以及KACs是否参与早期肺腺癌的发生？
肺腺癌患者以及小鼠模型的单细胞RNA测序数据的拟时分析结果共同提示KACs可能来源于2型肺泡细胞。研究者在上述小鼠模型的基础上，设计了能够追踪报告2型肺泡细胞来源（GFP标记）的基因工程小鼠，用来验证小鼠KACs是否来源于2型肺泡细胞。通过对Gfp标记的细胞类群（2型肺泡细胞来源）进行单细胞测序分析，鉴定出了包括2型肺泡细胞 ，KACs细胞，1型肺泡细胞，以及肿瘤细胞的多种细胞群。研究者对比了NNK处理组和对照组的细胞类群的丰度，结果显示NNK处理组的KACs，1型肺泡细胞以及肿瘤细胞的丰度增加，而2型肺泡细胞的丰度则降低。研究者利用Gfp标记的2型肺泡细胞培养了类器官（organoids）并进行了多重免疫荧光染色分析， 实验结果显示NNK处理组的类器官样本具有更强的KACs特征基因的表达。这些结果验证了KACs的2型肺泡细胞来源并显示了NNK暴露与KACs的高度相关，揭示了KACs和肺组织损伤以及肿瘤细胞生成的密切关。
最后，研究者构建了能够追踪KACs细胞的模型小鼠，使用谱系追踪（lineage tracing）技术回答此项研究的最终问题：KACs是否能转化成腺癌细胞。研究者使用免疫荧光染色技术分析了来自NNK暴露结束（处理组），NNK暴露后8至12周（跟进观察组）和肿瘤的样本。通过对比小鼠三组样本的免疫荧光细胞计数分析结果，研究人员发现肿瘤样本中绝大多数的细胞为2型肺泡细胞来源的，经过KACs细胞状态（Krt8+ Lamp3+）的细胞。此外，肿瘤样本中Krt8（KAC的标记基因之一）蛋白表达信号增强。谱系追踪模型小鼠的实验结果验证了2型肺泡细胞来源的KACs产生了肺腺癌细胞。
综合以上结果，这项大规模的多组学整合研究发现了KACs细胞在早期KRAS突变的肺腺癌中的重要作用，并使用转基因工程小鼠模型系统性地验证了KACs为来源于2型肺泡细胞的中间状态细胞，在2型肺泡细胞参与肺损伤修复，补充1型功能性肺泡细胞的生物学过程中，参与了Kras突变型的肺腺癌细胞的产生过程。这项研究揭示了肺腺癌发生过程和上皮细胞可塑性的重要联系，为肺腺癌的预防和早期干预提供了潜在的研究靶点。
MD安德森癌症中心的Humam Kadara教授，王凌华教授，及Jichao Chen教授为本研究的共同通讯作者。第一作者韩光春博士来自王凌华教授实验室，主要负责了此研究的生物信息学数据分析相关的工作，包括患者和小鼠的单细胞及空间转录组数据的分析以及多数据类型的整合等。共同第一作者Ansam Sinjab博士来自 Humam Kadara 教授实验室。

附招聘信息：

论文第一作者韩光春博士在山东大学获得生物科学学士学位，并在中国科学院北京基因组研究所获得生物信息学博士学位。韩博士于2017年夏天加入美国安德森癌症中心基因组医学系王凌华教授领导的计算生物学实验室，通过以数据为驱动的研究策略，在肺癌和血液癌研究领域以第一作者或共同第一作者，发表了多篇前沿性的研究成果（其中包括Nature 2024; Nature Medicine 2020; Cancer Discovery 2022, 2021; Blood Cancer Discovery 2022; Nature communications 2021）。韩博士正在积极寻求独立PI机会，研究兴趣包括捕捉肿瘤发生发展早期的重要细胞可塑性事件并理解其机制，利用计算生物学手段探索肿瘤耐药性相关的细胞水平改变以及如何利用这些改变提出临床治疗方式的改进策略等。联系方式：GHan1@mdanderson.org.

论文通讯作者王凌华博士是美国安德森癌症中心基因组医学系享有终身教职的副教授，同时也是计算生物学实验室的负责人。王凌华博士在计算生物学、肿瘤基因组，免疫肿瘤学，以及前沿的单细胞和空间多组学等方面拥有深厚的专业知识, 是美国多个肿瘤研究项目的主要负责人或共同负责人。她的团队应用先进的单细胞测序和空间多组学技术，并结合创新的生物信息学分析方法，深入剖析肿瘤细胞及其微环境的异质性, 表型可塑性, 细胞互作和动态演变。团队致力于更深入地理解和揭示早期肿瘤的发生，进展，治疗耐受和转移， 并致力于开发新的治疗靶点及有效的预测模型。近几年来，王教授团队在相关领域已经取得了一系列突破性的研究成果，发表科研论文110多篇 ，文章被引用 超过40,000次 （Google Scholar）。实验室成员作为first/senior/corresponding author（含共同）发表的论文包括Nature (n=3), Nature Medicine (n=3), Nature Genetics, Nature Biotechnology, Cancer Cell (n=3), Cancer Discovery (n=3) 等杂志。王教授团队科研经费充足，长期招聘博士生和博士后，邮箱：LWang22@mdanderson.org

论文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-07113-9