莽草酸和L-丝氨酸产量最高提高27倍和10倍

微生物细胞工厂是绿色生物制造的核心环节，已被广泛用于生物合成丰富多样的化学品、食品、药品和能源等。目前，已经利用合成生物学方法构建了多种可高效合成高附加值产品的微生物细胞工厂。

其中，谷氨酸棒杆菌被视为一种可安全生产食品原料和添加剂的重要工业发酵菌种，常用于生产氨基酸和有机酸。但是，在生产过程中，这种微生物也面临着生产效率较低、难以规模化生产等问题，一定程度上限制了目标产物的积累。

这些挑战的背后原因之一是代谢通量的复杂性，如果要提高目标产物的产量，往往需要精细调控代谢途径中关键基因的表达。

为了应对这一挑战，浙江农林大学的研究人员开发出了一种基于 CRISPR/dCpf1 的双功能调控系统，双向调节谷氨酸棒杆菌中多个基因的表达。将双功能系统应用于微调生物合成莽草酸和 L-丝氨酸的代谢通量，与原始菌株相比，莽草酸和 L-丝氨酸的产量最高分别提高了 27 倍和 10 倍。这项研究已于近日发表在Journal of Agricultural and Food Chemistry上。

论文中提到，这些发现表明基于 CRISPR/dCpf1 的双功能调控系统有潜力有效提高谷氨酸棒杆菌中目标产物的产量。

（来源：Journal of Agricultural and Food Chemistry）

领域内已开发出了多种应用于谷氨酸棒状杆菌的代谢工程工具，包括质粒、启动子和调控元件。这些工具可以促进谷氨酸棒状杆菌中所需基因的过表达，加强碳通量。

不过，由于细菌代谢途径的复杂性和质粒表达的局限性，基于基因敲除和过表达优化靶基因表达水平的方法既耗时又费力。因此，为了克服谷氨酸棒状杆菌中优化靶基因表达过程中的这些难题，领域内尝试利用 CRISPRi （基因抑制）代替基因敲除，CRISPRa（基因激活）代替利用高拷贝质粒或更强的启动子过表达基因，并取得了一些重要的进展。

不过，此前尚未报道过同时使用 CRISPRi 和 CRISPRa 对谷氨酸棒状杆菌进行双向基因调控的研究。在这项研究中，研究人员开发出了一种用于谷氨酸棒状杆菌的高效基因调控工具——CRISPR/dCpf1 双功能调控系统。

首先，通过融合 5 个转录激活域修饰 dCpf1 的 c 端，增加基因激活功能。在试验中，与对照组相比，dCpf1- sigh 和 dCpf1- SoxS 的激活强度分别增加了 1.36 倍和 1.41 倍，转录激活因子 dCpf1-SoxS 靶向 c 端的激活效果最好；然后评估了 dCpf1 与激活子融合后的转录抑制特性，他们发现融合 dCpf1-SoxS 表现出显著的激活和抑制作用，能够促进双功能调节谷氨酸棒状杆菌。

▲图 | 用于谷氨酸棒状杆菌的 CRISPR/ dcpf1 双功能调控系统（来源：上述论文）

基于这些试验数据，该团队选择 dCpf1-SoxS 构建双功能转录调控系统，进一步的实验结果证明成功构建了由激活子 SoxS 介导、协同 CRISPRi 和 CRISPRa 作用的双功能转录调控体系。该团队还发现了融合 dCpf1-SoxS 潜在的转录激活最佳位点——TSS 上游- 91 bp。

研究团队表示，该系统显示出在代谢调节中具有通用性，其有潜力为在谷氨酸棒状杆菌中生物合成高价值产物提供一种新策略。

接下来，该团队分别利用双功能调节系统 CRISPR/dCpf1 调节莽草酸和 L-丝氨酸在谷氨酸棒状杆菌中的代谢途径，尝试增加目标产物的产量。

莽草酸是芳香族氨基酸生产的关键中间体，如果要增加莽草酸的积累，需要调控葡萄糖运输系统和糖酵解过程以此增加前体供应。研究人员分别抑制 aroK、pyk、ptsH 和 hdpA 基因，发现同时抑制这 4 个基因的菌株 SYY-11 合成莽草酸的产量最高，比对照组提高了近 9 倍；然后分别激活 iolP、tkt、aroG、aroB 和 aroDE 基因，同时激活这 5 个基因的菌株 SYY-14 生产莽草酸的产量最高，产量增加了 12.33 倍；利用双功能调控系统同时抑制上述 4 个基因以及激活 5 个基因的菌株 SYY-17 合成莽草酸产量则比原菌株提高了 27 倍，有效实现了细胞生长、底物转化和产物积累的良好平衡。

由于提高 L -丝氨酸积累的主要方式是要阻断其降解途径，该团队利用双功能调节系统减少分支代谢途径的碳通量，增强关键代谢酶的表达，从而增加 L -丝氨酸的积累。

▲图 | 利用双功能调节系统调节 L -丝氨酸产生的代谢途径（来源：上述论文）

该团队分别抑制 glyA、pyk 和 gnd 基因，发现抑制这三个基因的菌株 SER-07 合成 L -丝氨酸的产量增加最明显，比对照菌株增加了 6.73 倍；然后分别激活 serA、serB 和 serC 基因，发现激活三个基因的菌株 SER-11 生产 L -丝氨酸的产量优于单基因激活；进一步利用双功能调控系统，抑制上述 3 个基因和激活上述 3 个基因的菌株 SER-12 在整个发酵生产 L -丝氨酸的过程中呈现出逐步稳定增加的趋势，最终积累的产量比对照菌株提高了 10 倍，SER-12 的副产物水平也明显下降。

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