FSAP|美国肯塔基大学熊幼翎教授：具有不同侧链基团的单酚酸对肌原纤维蛋白凝胶化的差异性调控

美国肯塔基大学GuoAnqi （第一作者）、熊幼翎教授（通信作者）等比较6 种酚酸（phenolic acids，PA），包括2 种羟基苯甲酸和4 种羟基肉桂酸衍生物，在氧化条件下对肌原纤维蛋白（myofibrillar protein，MP）凝胶特性的影响。

Introduction

PA是一组普遍存在于草药和香料中的植物酚类化合物，没食子酸（gallic acid，GA）、咖啡酸（caffeic acid，CFA）、绿原酸（chlorogenic acid，CA）和香豆酸（coumaric acid，CMA）是一些常见的化合物。与黄酮类化合物不同，PA通常更易于在低浓度的水溶液中溶解。在肉类加工中，通常在产品配方中加入香料和酚类提取物，以改善产品感官属性和氧化稳定性。许多PA显示出促进健康的生物活性，消费者对天然食品成分日益增长的需求进一步促进PA成为肉类工业中合成抗氧化剂优选替代品。

PA是1 种羟基苯甲酸或羟基肉桂酸，其基本结构是1 个或多个羟基和1 个附着在苯环上的羧酸衍生物。已知PA中的官能团容易通过非共价（不可逆）和共价（可逆）机制与肌肉蛋白相互作用。非共价力，包括氢键、疏水缔合和静电吸引，可归因于羟基、苯氧离子和PA中的芳环。在肉类加工中常见的氧化条件下，PA衍生的亲电醌类与蛋白质中的亲核氨基酸侧链之间会发生共价内合。蛋白-PA相互作用的主要后果之一是MP的物理化学和功能特性的改变。在热处理过程中，变性MP分子聚集并交联形成连续的三维凝胶基质，其功能是截留脂肪和水。

PA对MP理化性质的影响已经进行了广泛的研究。在肉类加工过程中，由于切碎和混合过程，通常会发生氧化反应，因此许多研究都是在氧化条件下进行的。在低至中浓度下，研究发现CA通过促进蛋白质展开和非共价结合，促进氧化应激MP的凝胶形成。相比之下，相同添加量的GA不仅有助于MP展开，还通过形成分子间二硫键诱导蛋白质交联。儿茶素中没食子酰和羟基的数量被证明是其改变MP理化性质功效的决定因素。同样，在PA之间观察到的差异可能与其固有结构有关。大量结构相关但分子排列不同的PA化合物值得从构效关系的角度进行探索。已经提出了几种确定蛋白质修饰效果的酚类结构，包括羟基的数量和位置、取代基的大小和衍生化。然而，人们对结构如何影响其与MP的相互作用知之甚少。

Results

氨基酸侧链基团含量变化

葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOx）介导氧化导致巯基和游离胺含量分别减少27%和42%（P＜0.05）；GA诱导的巯基和游离氨含量进一步减少7%和26%（P＜0.05）。

对照样品（无酚酸）包括非氧化（－Ox）和氧化预处理（＋Ox）。小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）。下同。

图1 在氧化环境中用不同PA处理对MP总巯基（A）、游离胺（B）、羰基（C）和表面疏水性（D）的影响

羰基含量变化

与对照样品（未氧化）相比，GOx介导的氧化显著增加了MP羰基含量，即从0.26 nmol/mg增加到1.39 nmol/mg（P＜0.05，图1C）。除SA外，PAs不会抑制氧化诱导的羰基化。

表面疏水性变化

在本研究中，只有CA（具有 5 个羟基和庞大的奎宁酸单元的最大PA）表面疏水性从150显著降低到131（图1D，P＜0.05）。

内源性荧光观察结果

PA和MP之间的相互作用促进了蛋白质结构的变化，表现为荧光被抑制和轻微红移（图2）。与2 种羟基苯甲酸（GA和SA）相比，4 种羟基肉桂酸（CMA、FA、CFA和CA）对MP的荧光光谱进行了更大修饰。此外，具有最多官能团的CA荧光强度降低程度最大（38%）且λmax偏移最明显（从338 nm到350 nm）。

图2 在氧化环境中不同PA处理的MP的内源性荧光强度

MP交联

图3D所示，GA导致肌球蛋白重链损失明显，同时形成聚合物。在非还原（图4A）或还原条件下（图4B），未加热的MP溶胶样品中没有观察到明显差异。此外，在非还原条件下制备的氧化和PA处理的样品没有出现蛋白质条带（图4C）。

图3 在非还原或还原条件下氧化环境中用不同PA处理的溶胶（A，B）和凝胶中MP（C，D）的SDS-PAGE图谱

蛋白质聚集和粒径

如图4A所示，在500 nm处测量光密度，在加热时所有MP样品的浊度均表现出S型变化模式：在40 ℃之前相对稳定，在50～55 ℃之间呈指数增长，在55℃之后上升变得缓慢。在加热之前，氧化的MP样品，无论是否含有PAs，均呈现浑浊状态，并且颗粒粒径比未氧化的对照组大（P＜0.05）。在加热过程（72 ℃）结束时，由于交联增强，大多数PA处理的样品表现出比对照样品更高的浊度。

通过计算浊度变化的一阶导数 (dA/dT)来比较蛋白质聚集的速率。所有样品在约45、58 ℃处均显示出2 个过渡峰。根据主峰大小，与其他PA处理相比，GA处理导致蛋白质聚集略有延迟，彼此之间没有显著差异。

凝胶性质

在加热过程中，当MP溶胶转化为黏弹性凝胶时，在40～50、50～60 ℃的温度内出现了2 个特征流变转变峰（图5A）。储能模量（G′）在接近最终加热温度时达到平稳期，与未氧化的对照相比，氧化显著提高了最终G′。PA的添加导致弹性属性的进一步改善，其中GA和CA最有效：分别使G′增加36%和31%（P＜0.05）。

图6 在氧化环境中用不同PA处理的MP的G′（A）和凝胶强度（B）

综合比较

表1显示了PA化合物在MP的结构变化、聚集和凝胶化中的相对活性。尽管GA诱导后的构象变化较小，但GA处理的MP的弹性显著增加（P＜0.05）。

表1PA对MP性质相对影响的综合比较

Conclusion

当PA分子较小时，其结构阻碍较小、还原潜力较大，促进了蛋白质交联和凝胶基质形成；而较大的分子具有更多的取代基，增强了蛋白质的展开和聚集速率。具体效果与羟基、甲氧基和其他官能团的数量和位置有关。在比较的6 种酚类化合物中，GA和CA倾向于改变氧化应激的肌原纤维蛋白的聚集和凝胶化行为。研究结果表明，酚酸成分的变化可能是加入不同富含酚酸香料的肉制品质地不一致的原因。因此，肉类加工中的植物酚类成分应根据这些活性化合物的组成和结构进行选择，以形成理想的产品质地特征。需要进一步的研究来评估酚酸在更复杂的原位环境中对肉蛋白凝胶化的影响，即在与复合肉制品系统非常相似的其他主要食品成分（如脂质和多糖）存在的情况下。

Abstract

Six phenolic acids (PAs) with related structures, i.e., gallic acid (GA), syringic acid (SA), coumaric acid (CMA), caffeic acid (CFA), ferulic acid (FA), and chlorogenic acid (CA), were compared for their effects on the gelling properties of myofibrillar protein (MP) under oxidative conditions. Of the six PAs, only the smallest GA caused significant reductions of free amine and sulfhydryl content (by 26% and 7%, respectively, P < 0.05) and SA decreased protein carbonyl formation, while CA, the largest PA with an esterified quinic group, prevented oxidative loss of amines. All PAs quenched MP fluorescence with CA showing the highest efficacy (38% suppression). During thermal gelation, the GA-modified MP displayed the strongest myosin cross-linking. The elasticity (G′) and breaking strength of MP gels were markedly enhanced by the addition of PAs, and the final G′ value ranked in the order GA > CA > FA > CMA > SA > CFA, indicating complex roles of phenolic side groups.

作者介绍

熊幼翎 教授

美国肯塔基大学

美国肯塔基大学动物与食品科学资深教授，大学杰出研究教授。IFT肉品科学分会前任主席，食品蛋白质化学与功能和肉品加工领域知名专家。通过基础和应用研究相结合开发非传统蛋白资源。发表了SCI文章320余篇，在国际学术会议作大会特邀发言140余次，并组织了40余个国际学术会议。培养的博士、硕士在全球（包括中国）大学和食品工业发挥领导作用。在培养年轻科学家同时，担任众多美欧亚太国家科研基金评委以及科研杂志编辑，提供专家技术服务。开创或引领了蛋白氧化、肽功能、蛋白结构—功能关系，以及蛋白与酚和其他小分子相互作用在功能食品发展的基础性研究。获的了众多美国和世界其他国家食品科学技术成就奖，也是4 个学术领域的Fellow（IFT, ACS, IAFoST, AMSA）。崇尚并致力于肉品科研国际合作，造福于人类。

翻译/编辑：李婉君、龚艺、王雨婷；责任编辑：张睿梅

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Food Science of Animal Products（ISSN: 2958-4124, e-ISSN : 2958-3780）是一本国际同行评议、开放获取的期刊，由北京食品科学研究院、中国肉类食品综合研究中心主办，中国食品杂志社《食品科学》编辑团队运营，属于食品科学与技术学科，旨在报道动物源食品领域最新研究成果，涉及肉、水产、乳、蛋、动物内脏、食用昆虫等原料，研究内容包括食物原料品质、加工特性，营养成分、活性物质与人类健康的关系，产品风味及感官特性，加工或烹饪中有害物质的控制，产品保鲜、贮藏与包装，微生物及发酵，非法药物残留及食品安全检测，真实性鉴别，细胞培育肉，法规标准等。

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