EHP检测为什么会假阳性？为什么难以防控？养殖专家跟你透露！

前言：

对虾养殖专家Robins McIntosh博士，分享了虾肝孢虫（EHP），及其与全球对虾养殖业的影响，今天，小编分享第1部分。

EHP起源于20世纪90年代末的斑节对虾 ( Penaeus monodon )，并且2004年在泰国的南美白对虾 ( Litopenaeus vannamei ) 中得到了确认，但它很快就扩展到全球范围内，以难以捉摸的方式传播，由于诊断方法有限，常常无法正确识别。

虾肝胰腺中的（EHP）孢子

一、EHP的历史

首先，介绍一下EHP的历史，许多人称其为突发疾病，已经存在了一段时间。早在20世纪80年代末就有斑节对虾（Penaeus monodon）被感染的记录，现在看起来它们可能就是EHP。但2004年，它在泰国的对虾中得到了确认。而我第一次接触EHP是在2011年的泰国；当时是在泰国，确实有EHP引起疾病的病例。

然后，在2012年曼谷GOAL会议期间，我带Donald Lightner博士来到我们的一个实验室，并向他展示了他在来自泰国的病虾中获得的第一个EHP。我们在HP中观察到小元素的簇，Donald Lightner博士也从来没有见过，因为他确实无法辨认。我们只知道这些东西会影响虾的肝胰腺（HP），并且也可以引起其他问题。所以，在那时起，这是一个悬而未决的问题。

之后，它迅速蔓延到中国，我记得大概在2012-2013年之间在中国出现，当时中国的对虾养殖中也存在EHP问题，但是当时并未确定，事后才被确认为EHP。

与此同时，我们在肠道中发现了类似于gregarines（一种感染虾和其他水生动物的常见寄生原生动物）的结构。

随着时间的推移，我们开始了解到，这些类似gregarine的结构，这些ATM（聚合转化微绒毛）与EHP相关，并且在许多地方都可以观察到。但是当时没有PCR技术，一切都是通过显微镜检查来寻找这些小孢子，因此当时很难正确识别它们，这需要你拥有很好的观察力和专业性，才有可能识别它们。

还值得注意的是，这些虾最大的特征是生长缓慢，具有较高的变异系数（CV），但似乎不会导致任何生存的问题。

现在，使用孢子作为诊断并不总是100%准确率，因为EHP有两个阶段。在孢子形成阶段，有孢子，然后是孢子体，孢子看起来像HP组织，而孢子体，必须使用PCR或原位杂交来识别它们，如果它处于孢子体阶段，通常会导致EHP的诊断错误。

随着时间的推移，我们看到EHP出现越来越多的地方，比如：越南、菲律宾、印度尼西亚……，它真正开始袭击印度是在2015年或2016年，而且总是伴随着亲虾的移动而传播。EHP的传播是通过虾进行的，这是我们目前所知的最活跃传播通道。当然，可能还有其他的携带者，但目前这些携带者尚未被充分识别或诊断不足。由于当时诊断EHP无法做到100%准确率，因此，它通过亲虾进入了许多国家。

聚集的转化微绒毛 (ATM) 是类似于聚结蛋白的结构，经常在受感染虾的肝胰腺中观察到。

Donald Lightner博士当时依赖显微镜检测EHP，但也有失误。在诊断上，直到2014年EHP PCR引物的实施，我们才能够确定地诊断EHP。在此之前，第一个引物是肠细胞动物的通用引物，并产生了许多假阳性。特定的EHP引物是由Tim Flegel 博士的实验室与英国其他研究人员合作开发的。这些引物基于检测该特定EHP的孢子壁，因此它更具特异性，并且几乎没有误报。在这些特定的引物出现之前，您会多次测试虾饲料、磷虾粉和鱼粉等饲料成分，以及不同的其他物质，结果可能会出现EHP假阳性。

二、亲虾和EHP的关系

对于我们的亲虾，我们制定了一项核心育种计划，这是一项非常严格的生物安全计划：EHP和这些动物的任何阳性结果都将被排除。现在，由于EHP位于HP中，因此非破坏性测试方法是通过粪便样本进行测试，因此您只需测试孢子。因此，如果没有孢子，就无法得到阳性结果，这可能会导致假阴性。但另一方面，如果您给亲虾喂EHP呈阳性的饲料，并且您正在检测粪便，那么粪便呈阳性，那就是假阴性。在我们真正理解这一点之前（这可能是在2014年左右），有一次我们收到一份报告，称我们的几个亲虾池对HP呈阳性。我再次对他们进行了测试，结果再次呈阳性。所以，我们不得不在几个池的亲虾处理掉，损失价值可能超过1万美元。

但后来我想到下次遇到类似情况时测试一下HP，结果HP为负。然后对饲料进行了测试，饲料呈阳性，我们意识到仅仅测试粪便，可能会犯下严重错误。因为如果饲料呈阳性，粪便也会呈阳性，而且今天仍然有不少饲料呈阳性，所以你必须在检测中认识到这一点，一些磷虾粉和一些鱼粉的饲料，检测结果可能也呈阳性。

如果结果呈阳性，您确实必须进入并测试HP组织，以确定EHP是否存在在肠道中，最终才确定饲料含有EHP，还是虾感染EHP。现在，更具特异性的引物确实降低了这种可能性。但也有一种可能性是，EHP仅仅因为它存在于粪便中，就可能因为虾没有形成孢子而被诊断不足，或者因为你给虾喂的饲料也对EHP呈阳性，所以它可能被过度诊断。为了进行真正的验证，您应该测试肝胰腺和整个HP的匀浆，因为感染可能位于HP中，而不是均匀分布在整个HP中。

而且由于孢子分布不均，而且数量可能很少，因此必须极其耐心地进行组织学检查，观察HP的许多切片，以诊断不存在孢子。在PCR技术使用之前，许多感染被遗漏了，因为使用正常的染色技术很难看到孢子。

从历史上看，EHP本身会导致虾的生长缓慢和尺寸变异系数 (CV) 高。

最初，该疾病导致生长缓慢，且尺寸变异较大（或CV超过25%）。CP基因的虾平均每天的生长速度至少超过0.18克，在大多数情况下，平均日增重 (ADG) 低于0.15的任何情况都可能是EHP感染。EHP的定义特征是虾尺寸变化，类似于传染性皮下和造血坏死病毒 ( IHHNV ) 和畸形综合症 (RDS)。

我开始注意到的另一件事是，EHP要么会在虾生产周期的早期出现，要么会在虾生产周期的后期出现。如果养殖场在30天时报告虾生长缓慢（判断依据：30天时虾的正常大小为2.5克，但现在在30天时，虾的大小将小于1克），这一般很大几率表明感染来自于孵化场。如果EHP感染来自环境，则生长要到45至50天才会受到影响。

对于源自孵化场，并在30天之前感染（并且出现生长缓慢的虾）来说，是没法获得经济回报的。因此，在前30天，虾的生长情况，是判断EHP是源自孵化场还是来自池塘环境的一条好线索。

后来，通过实时PCR，我们了解到EHP DNA的水平决定了是否有疾病，在浓度为10的1次方至10的3次方时，虾只是EHP的携带者，没有明显的疾病（比如：生长缓慢），但当浓度超过10的3次方时，虾开始生长缓慢。如果水平达到10的6次方至10的8次方，虾的生长会显着减少。

另外，如果池塘中发现EHP，需要采取具体措施从池塘中清除感染性孢子。

三、虾苗孵化场和EHP

如果一个孵化场怀疑有EHP，必须对其进行消毒，而孢子很难清除。有报道称，35至40ppm的氯、高锰酸钾或福尔马林在实验室条件下都可以消毒；但经验表明，这些消毒剂在具有保护性生物膜的环境中是无效的。

在孵化场中，要对表面进行消毒，必须使用酸化氯 (200 pm/pH 4.0) 溶液，例如：氢氧化钠溶液 (pH >12)。这些溶液会分解生物膜并溶解孢子壁。需要注意的是，要真正清洁对于孵化场，整个设施必须进行消毒，包括：池子和管道。

如果孵化场有EHP，操作员应确定EHP是如何进入孵化场的。最明显的3个途径是：

1、亲虾（或者幼体）；

2、活的或新鲜的亲体饲料（任何滤食性动物都可以引入 EHP）；

3、水源。

为了测试水质，可以通过Whatman过滤器过滤几升水，然后通过PCR进行测试。切勿使用来自受感染地区的池塘饲养亲虾，最好使用来自公认来源的真正经过认证的SPF亲虾。另一个主要感染源是滤食性动物，如：多毛类、双壳类和成年卤虫，它们常作为亲虾饲料。

在泰国，我们会每月或每周监测一次水质，具体取决于您孵化场的历史。而且您必须拥有经过SPF认证的亲虾。实际上，预防EHP，不仅仅是PCR测试那么简单，如果亲虾来自没有EHP历史的设施，那么它就不会含有EHP。另外，亲虾粪便也必须进行测试，因为一开始您可能会错过它，因为它可能是孢子体。此外，孢子或DNA的水平对于获得阳性检测非常重要，而且对于亲虾，您无法检测肝胰腺并保持亲虾的存活。因此，从历史悠久、经过真正认证的设施获取亲虾非常重要。

一旦我们有了干净的亲虾，我们就把它带入干净的孵化场。我们不在EHP感染区域，所以水很干净。现在我们只需确保不引入含有EHP的亲虾饲料即可。我们不想要在EHP区生产的活多毛类、活卤虫或卤虫生物质，另外，通过PCR对所有这些进行测试以确保饲料是干净的，这当然不是一件坏事。

最好的选择是培养的SPF或多毛类动物，经过认证的无病原体多毛类动物。在我看来，亲虾饲料中，鱿鱼通常是安全的，但我不会使用任何双壳类动物（牡蛎、蛤、贻贝），因为任何滤食性动物都可以过滤和保留EHP孢子并成为EHP的载体。另外，多毛类以沉积物为食，沉积物可以将EHP孢子带入它们的肠道，这些都是EHP感染亲虾的方法。

虾苗孵化场在其亲虾饲料中，应仅使用无病认证的多毛类动物。

如果您小心处理饲料的问题、对孵化场进行了消毒、拥有清洁的水源，那么您应该能够在孵化场中保持无EHP的状态。现在，如果您处于高度感染的地区，例如：印度、越南或泰国的一些孵化场地区，那里既有孵化场，也有养殖场，并且您的环境中存在EHP，那么您可能会在孵化场水中发现EHP ，这样的水源，一定要消毒。

查看其他孵化场的历史记录时发现，它们通常没有正确消毒。因为现在大多数孵化场只是喷洒40ppm氯制剂，但我认为这想控制EHP很困难。想真正降低孵化场水中EHP感染可能性的唯一方法是对孢子进行物理过滤，而不是化学消毒。这些孢子的大小小于两微米。您必须使用可以去除水中2微米颗粒的超滤装置，这样就可以完全去除EHP。但是需要注意，一旦安装，过滤器必须进行维护以保持有效。

如果您能够正确过滤水源，并拥有干净的亲虾、干净的饲料，水源是干净的，我们还要通过某种机制确保没有孢子进入设施，比如：孵化场必须始终有监控计划，监视应该是例行的，或者定期检查虾苗。

现在，当您检查虾苗时，还有另一个问题是——如果孵化场只有低水平的EHP感染，那么它可能会低于检测水平，导致无法检测到。所以，我一直做的就是对虾苗施加压力，所以现在我要讨论压力放大EHP的效果。因此，如果您拿走一袋虾苗，并通过24到28小时运输，那么运输压力可能将EHP大量复制，这就到了可以通过PCR轻松检测到的程度。因此，如果虾苗已经经过了长时间运输，到了我们的养殖场，如果测试结果还是阴性，我们就会更有信心相信虾苗是不会携带EHP。

因此，大约11或12年前，我们开始在显微镜下观察所谓的聚集转化微绒毛 (ATM)，后来我们发现这些ATM与EHP感染有关，EHP感染会释放大量孢子，并导致HP组织脱落。

四、EHP与白便之间有密切的关系

EHP与白便病 (WFD) 之间存在明显的关联，白便病是虾的另一种严重疾病。左：受WFD影响的虾的切除肝胰腺。右图：虾池边缘出现典型的WFD症状。

白便于2014年成为养虾业的一个问题，并且随着时间的推移，问题变得越来越严重。但2014年并不是第一次报告有白便疾病。第一次是在2000年代初期的斑节对虾养殖中发现，白便通常表明有EHP感染。当出现白便时，这种疾病比单独的EHP更严重，虾的生存都成为问题。那么问题就变成了是什么原因导致了白便。我们知道EHP是必需的因素，但是还需要什么呢？

我注意到白便最常发生在底部不好和塑料薄膜破损的池塘中。破损的池塘底部会在其下方形成厌氧条件，从而溢出到池塘中。这种情况经常发生在养殖场为了节省成本而使用的非常薄的薄膜中。在这些池塘中，您最有可能发现带有EHP的白便。如果虾农用光合细菌处理这些池塘，白便的情况可能会减轻甚至逆转。

因此，为了寻找白便的原因，我开始关注厌氧菌。因此，我们的实验室出去收集厌氧菌，也购买了厌氧罐，这样我们就可以在实验室培养厌氧细菌。我们会在厌氧罐中培养白便中的细菌，分离这些细菌，然后将这些细菌添加到有或没有EHP的虾中。当我们将某些细菌与EHP一起添加到虾中时，我们很快就会得到白便。如果我们添加没有EHP的虾中，虾就不会出现白便，因此，这两者显然存在联系。

当我们用EHP鉴定出产生白便的细菌时，它是一种名为丙酸杆菌 (Propionigenium)的厌氧细菌。自从我们研究丙酸菌以来，该属的其他细菌据报道，弧菌也会产生白便，但也只有在存在EHP感染的情况下才会产生。

一种称之为丙酸杆菌 (Propionigenium)的厌氧细菌，已确定与EHP一起引起虾的白便。

泰国玛希隆大学的Kallaya博士从泰国的几个地区收集了白便，Kallaya博士对这些粪便进行了宏基因组原始细胞分析（基本局部比对搜索工具，BLAST，最著名和最常用的DNA搜索和比对工具），以识别细菌和白便，她发现所有白便虾共有的细菌是丙酸杆菌。

我在危地马拉收集过白便，也收集过丙酸杆菌 (Propionigenium)，确认它无疑是白便的主要参与者。尤其是它是厌氧的，一般来说，您会在底部不好、有厌氧区域、残饵多的池塘中找到它，这些厌氧区域将为丙酸杆菌根提供栖息地。当丙酸杆菌或弧菌菌株进入带有EHP的虾体内时，它会放大EHP的效果，这将获得比单独患EHP更糟糕的结果。

从我角度来看，最重要的方面是确保我们的亲虾不携带丙酸杆菌。因为如果我们的亲虾将这种细菌带到孵化场，它们就会将其传递给其他亲虾。现在，也许虾苗没有EHP，所以没有效果。但如果携带丙酸杆菌的虾苗进入有EHP的池塘，我们就会发现白便，或者情况会更糟。因此，这是孵化场可以采取的另一个筛查措施，以确保其孵化场不会传播这种细菌。

五、压力越大，虾感染EHP的几率就越大，严重程度更重。

美洲的EHP水平较低，但它似乎并不是导致虾患病的主要原因。在美洲许多养虾国家都发现了它，但它在HP中以低频存在，并且在HP中不放大，因为它是低频。这是不同的EHP吗？我们确实从危地马拉获取了EHP，我将其送去进行测序，结果与亚洲EHP相同，至少危地马拉没有什么不同。

那么为什么它会在亚洲引发大规模疾病，而不是美洲引起大规模疾病呢？对我来说，这是试图理解EHP时要问的一个关键问题。我得出的结论是，这一切都与压力和养殖密度有关。让我们看一下危地马拉的案例，该国是美洲的一个“密集型”对虾类养殖国家，与亚洲一样，也存在严重的EHP问题。

我们发现，如果我们在半密集或低密度的养殖条件之下，你可能有低频EHP，可能无法检测到，并且虾没有疾病，但存在病原体。如果我们将这些虾放入高密度养殖系统中，结果是出现跟亚洲一样的EHP疾病。所以这让我相信压力是一个主要因素。

另外，我在2016年，EHP在泰国造成了许多问题。我要去看看有EHP问题的养虾场。我一边吃着早餐，一边看着同一条潮汐小溪上的邻近养虾场。他们做得很好，表现非常出色，而距离它很近的另一个养虾场却是一场灾难。

所以，我问第一个养虾场的经理他们是否有EHP，他说是的，有EHP（孢子虫），但没有疾病。他通过机械曝气向池塘补充氧气。这个人恰好是一个曝气机供应商，所以他进行了大量的曝气，并且他将池塘溶解氧（DO）保持在6ppm以上。他告诉我，如果你保持高溶解氧，虾就会很好，环境也很好，即使密度较高，对虾的压力也较低，由于溶解氧水平较高，压力较低，并且不会出现EHP疾病。所以，我去了另一个养虾场，那个有问题的养虾场，我检查了他们的溶解氧，它低于5ppm，EHP的问题已经十分严重了。因此，如果池塘的溶解氧含量较低，由于溶解氧较低的压力，EHP往往会占据主导地位。

当然，池塘中可能存在许多压力源，这会使EHP感染恶化，并在虾HP中繁殖。低氧是一种压力，另外，硫化物、高有机物、亚硝酸盐、氨、二氧化碳和其他物质也是如此。但是，较高的养殖密度和较高的投喂率，确实会在池塘中产生更大的压力，并导致这些池塘中EHP的严重程度更高。

作为亲虾生产者，我们所做的事情之一就是尝试创造耐受性。EHP一直是耐受性的真正挑战，因为它不是简单的生物测定，也不是简单的挑战测试，需要数周甚至数月的时间。

您如何控制感染水平和其他因素？这非常困难。另一个问题是，是否存在对EHP的耐受性？我认为最好考虑EHP，而不是遗传解决方案，以提出管理解决方案。

当EHP进入某个地区时，它的初始水平较低。现在，当它的水平较低时，我们可以更好地控制它，但随着它的增加，意味着一个又一个的养虾场越来越多地受到感染，所有的孢子都进入环境中，水平就会上升，这就是为什么我们养虾场的严重程度一年比一年高。它从X开始，明年它是X加10%。后一年，这个数字再增加10%……，随着环境中感染水平的增加，它会变得越来越高。

另外，我发现亚硝酸盐对虾来说是一个巨大的压力源。我在挑战试验中添加一点亚硝酸盐，就会增加感染率。如果培养物中含有少量亚硝酸盐，您确实可以得到高水平EHP感染的虾。当然，压力源可以是低氧、亚硝酸盐、pH值波动、硫化物、有机物等，无论什么环境压力都可能为EHP创造环境，并成为一个非常非常严重的问题。