芦丁2小时内完全水解并转化为异槲皮苷和鼠李糖

异槲皮苷也称异槲皮素，是一种天然存在的黄酮醇类化合物，具有抗炎、抗氧化、调节血脂血糖等多种生物活性，在医药和食品行业有着广泛应用；鼠李糖是一种天然存在的单糖，是许多植物糖苷的组成部分，可用于制备香料、合成心脏病治疗药物等，另外其在化妆品中也常被用作活性成分实现保湿、舒缓皮肤等。

然而，这两种高价值化合物传统的生产方法（比如植物提取、酸性水解等）面临提取和分离困难、产生无价值副产物等一系列挑战。作为合成异槲皮素和鼠李糖的理想前体，芦丁是一种非常容易获得的天然化合物，基于芦丁合成和制备二级糖苷和增值单糖是一种低成本、可持续的生产方式。

近日，江苏大学药学院沈玉萍、杨欢教授团队开发出一种通过芦丁酶促水解制备异槲皮苷和鼠李糖的新方法，2 小时内即可实现完全水解和转化。目前，这项研究已经以“Preparation of isoquercitrin and rhamnose from readily accessible rutin by a highly specific recombinantα-L-rhamnosidase (r-Rha1)”为题发表在Natural Product Research上。

（来源：Natural Product Research）

芦丁属于天然存在的黄酮醇类化合物，具有较好的生物活性，比如抗炎、抗氧化、抗过敏，以及在防治肥胖、糖尿病和癌症等方面也能发挥一定功效，而作为芦丁的糖基化产物，异槲皮苷具有比芦丁更高的生物利用度、抗氧化和抗炎活性以及抗突变作用等。

虽然异槲皮苷比芦丁具有更好的生物活性，但其传统生产方法（比如酸性水解，鼠李糖的传统制备方法是从芦丁的酸性水解物中分离提取）通常会导致产物的不稳定性，并且产生大量不需要的副产物，对环境造成污染，并且自然界中的异槲皮苷存量极少，相较之下，芦丁在自然界中的分布非常广泛，在槐米、荞麦、芸香、沙棘、银杏、枸杞等多种常见的植物（或果实、种子）中都含有芦丁，其中以槐米、荞麦的含量最高。

数十年来，业界围绕从天然糖苷中制备高值产物开展了大量研究，出于经济和环保的考虑，酶水解已成为当前将糖苷转化为其他重要化合物的主要方法之一。

▲图｜芦丁酶促水解制备异槲皮苷和鼠李糖示意（来源：Natural Product Research）

在这项研究中，沈玉萍、杨欢团队构建了一种芦丁酶水解高效合成异槲皮苷和鼠李糖的新策略。首先，他们在毕赤酵母 GS115 中表达具有高活性、高特异性的重组 α-L-鼠李糖苷酶（r‑Rha1），并将其用于芦丁的酶水解。

作为一种重要的生物技术酶，α‑L‑鼠李糖苷酶常用于天然产物的去甲酰化，其能够精准、高效的水解许多糖苷类物质（比如芦丁）末端的 α-L-鼠李糖基。此外，先前研究发现一些重组 α‑L‑鼠李糖苷酶也拥有较好的水解活性和高特异性，因此将其作为芦丁去甲酰化的关键工具。

与此同时，相较于常用的大肠杆菌表达系统，毕赤酵母 GS115 表达系统具有高细胞生长密度、高细胞外表达以及下游纯化过程简单等特点，在表达异源糖苷酶方面更具优势。

接下来，他们对酶水解反应条件进行单因子法（OFAT）优化并得到最佳反应条件，即在含有α-L-鼠李糖苷酶/芦丁（1:4，w/w）的醋酸-醋酸钠缓冲液（0.02M、pH4.5）中，在 60°C 条件下合成了两种目标化合物，随后他们将酶水解系统放大至 20 g/L 的水平。

结果显示，芦丁浓度为 20 g/L 时，在优化后的反应条件下 2 小时内完全水解并转化为异槲皮苷和鼠李糖，通过 HPD-100 树脂纯化后得到异槲皮苷，通过脱色和结晶富集鼠李糖。

值得注意的是，由于 α-L-鼠李糖苷酶对芦丁具有更强的亲和力，可能是其高水解效率的原因所在。更进一步，他们通过分子动力学模拟分析发现，芦丁在 α-L-鼠李糖苷酶的疏水表面被催化，以范德华力为主要驱动力。

总的来说，这项研究构建了一种通过重组酶、基于芦丁酶水解来高效合成异槲皮苷和鼠李糖的新方法，研究人员在论文中指出，这种新开发的高效简化工艺在低成本、绿色合成异槲皮苷和鼠李糖方面具有工业应用潜力。

▲图｜江苏大学药学院沈玉萍、杨欢教授（来源：江苏大学官网）

该论文的共同通讯作者沈玉萍是江苏大学药学院副教授，她课题组的研究方向为中药活性成分获取新方法（生物转化及酶催化）、天然药用资源循环再利用，以及蛋白质组学技术在动物药质量评价中的应用等领域；另一位共同通讯作者杨欢，是江苏大学药学院教授、博士生导师，他课题组的研究方向主要围绕动物药鉴定关键技术、生物转化和酶催化制备中药活性成分等领域。

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