上海团队发现自闭症新基因位点，首次用基因编辑改善小鼠自闭行为

·在这项研究中，研究者们发现了与自闭症密切相关的MEF2C基因上一个新的致病位点p.L35P。在这个位点上发生突变的小鼠产生了与自闭症相似的症状。随后，研究者们开发了一款能够直接编辑单个碱基的基因编辑器，将其嵌入病毒外壳中并给基因突变的小鼠注射，使突变的基因成功得到纠正，改善了小鼠的自闭症行为。

论文截图。图片来源：《自然·神经科学》

2023年11月27日，上海交通大学医学院松江研究院/中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心（神经科学研究所）仇子龙团队与复旦大学脑科学转化研究院程田林团队合作在国际神经科学权威期刊《自然·神经科学》（Nature Neuroscience）上发表题为《全脑体内基因编辑逆转了Mef2c变异小鼠的行为变化》（Whole-brain in vivo base editing reverses behavioral changes in Mef2c mutant mice）的研究论文，首次报道了在全脑范围内利用单碱基编辑技术成功改善Mef2c自闭症小鼠模型神经发育与自闭症样核心行为表型。

在这项研究中，研究者们发现了与自闭症密切相关的Mef2c基因上一个新的致病位点p.L35P。在这个位点上发生突变的小鼠产生了与自闭症相似的症状。随后，研究者们开发了一款能够直接编辑单个碱基的基因编辑器，将其嵌入病毒外壳中并给基因突变的小鼠注射，使突变的基因成功得到纠正，改善了小鼠的自闭症行为。

图I: L35P点突变显著降低MEF2C蛋白表达水平。
图II： L35P点突变通过泛素化蛋白酶体降解途径介导MEF2C蛋白翻译后快速降解。
图III： Mef2c L35P杂合小鼠表现出与孤独症相关的异常神经发育，突触密度降低，抑制性中间神经元数量下降及异常的电生理表型，且出现孤独症相关的行为学表型。
图IV： 基于CRISPR/Cas9系统开发的新型胞嘧啶单碱基编辑系统，通过体内及体外验证了其在目标靶点的碱基编辑效率以及脱靶事件，证明该系统是高效，准确且安全的。
​​​​​​图片来源：《自然·神经科学》

“目前，自闭症的治疗是医学中的难点之一，尚没有特效药能够治疗自闭症。”对于该研究，上海科技大学的朱俊杰博士与陈佳研究员评论道，“这项研究证明了体内碱基编辑在神经发育障碍治疗中的潜力，同时也为其他类型的碱基编辑器在脑内递送以及编辑带来了新的启发。”

p.L35P基因突变或导致自闭症

自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder，简称ASD），是一类严重影响儿童身心健康的神经发育疾病，患者表现出严重程度不同的社交障碍以及重复刻板行为。

根据美国疾控中心统计，自闭症的发病率呈逐年升高的趋势，2022年美国自闭症患病率约为1/361。中国对于6-12岁自闭症儿童患病率的统计显示，男孩约为0.44%-0.95%，女孩约为0.12%-0.30%。

自闭症与先天和环境条件密切相关，而基因被视为重要因素之一。近年来研究者们发现了数百种自闭症风险基因及致病基因突变，包括与神经粘着分子、离子通道蛋白等神经细胞中的各种蛋白质表达相关的基因。其中，Mef2c基因已被证实是一个很重要的自闭症风险基因，突变会导致神经发育迟滞及一系列严重症状。

“有研究结果表明，Mef2c基因在成年小鼠的大脑皮质、海马体和杏仁核中大量表达，其能够调节突触可塑性和谷氨酸能突触的数量，是ASD相关基因网络的调节基因之一。Mef2c的突变会导致儿童大脑发育缺陷，其特征为精神运动障碍，缺乏言语，异常运动模式等。”朱俊杰博士与陈佳研究员评论道。

一段具备特定功能的基因序列中的单个或多个碱基变化都可能对功能产生影响。在本研究中，仇子龙研究团队通过全外显子组测序技术在一例中国的自闭症患儿的Mef2c基因上发现了一个新发点突变（de novo mutation）, c.T104C，p.L35P。这个新发点突变对于Mef2c基因功能的影响未知。

为了研究该位点对Mef2c的影响，研究团队首先利用分子细胞生物学的研究方法在体外探究了 L35P 点突变对 Mef2c蛋白结构、表达以及功能上的影响及其分子机制。研究团队发现 L35P 突变会导致 Mef2c蛋白质发生依赖泛素化蛋白酶体途径的快速降解，最终显著降低Mef2c蛋白的表达水平。

随后，研究团队构建了Mef2c L35P 点突变敲入小鼠模型，并通过生物化学、免疫荧光成像以及行为学实验探究了其神经发育及行为学表型。研究发现Mef2c L35P 杂合突变小鼠大脑中存在自闭症相关的神经生理学特征以及发育异常现象，并且表现出社交障碍以及刻板行为等自闭症核心症状的行为学表型。

体内基因治疗修复小鼠变异

目前研究多集中在基因突变导致自闭症的分子与环路机制上，是否可以运用基因编辑方法对导致自闭症的基因突变在大脑内进行准确的修复还未见报道。在本研究中，研究者们使用首次使用基因编辑修复了自闭症小鼠神经元中L35P的基因突变。

CRISPR/Cas9系统是细菌和古细菌在不断进化的过程中产生的适应性的免疫防御机制，通过这一系统细菌能够识别并剪切外来的噬菌体和病毒的DNA。在其基础上，科学家们开发出了一套基因编辑系统，使得精确高效的基因编辑成为可能。这项技术的风险之一在于，CRISPR/Cas9可能会与不是目标序列的DNA产生错配，进而导致非预期的基因突变，这被称为“脱靶效应”。

在本研究中，仇子龙和程田林团队合作开发了一种基于CRISPR/Cas9 的新型胞嘧啶单碱基编辑系统 （APOBEC3A embedding Cytosine Base Editor，AeCBE，已申请相关发明专利），使其能够将小鼠Mef2c基因中特定位置上异常的 C·G 碱基对转换成正常的 T·A 碱基对。

为了能够使得新型CBE系统成功地跨越小鼠血脑屏障（blood brain barrier， BBB），研究团队将AeCBE 系统包装进PHP.eB血清型的腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）中，并且利用单次小鼠尾静脉注射AAV的递送方式，使得AeCBE系统在小鼠大脑中多个脑区得以成功表达。经AeCBE系统编辑后，研究团队在体内检测到较高的单碱基编辑效率以及低脱靶事件，验证了新开发的AeCBE系统具备高效性、准确性且安全性的特点。

最后，研究团队检测了经过AeCBE系统介导的基因治疗后Mef2c L35P突变杂合小鼠大脑中的神经生理学变化以及行为学表型。在经过单碱基编辑技术介导的基因修复后，研究团队发现Mef2c L35P突变杂合小鼠大脑中降低的Mef2c蛋白表达水平得到恢复，并且其社交障碍以及重复刻板性行为也得到了明显的改善。

这项研究成果表明基因编辑技术有望为脑部遗传疾病患者带来福音。“近年来，碱基编辑技术已广泛应用于生命科学的众多领域，特别是基于血红蛋白病、早衰症、视网膜病变、神经肌肉病、心肌病、耳聋等疾病的基因治疗。”华东师范大学李大力教授说，“这项研究通过在体全脑碱基编辑首次实现了自闭症小鼠的有效治疗，为自闭症治疗提供了新的思路，并进一步表明了碱基编辑技术治疗遗传性脑部疾病的巨大潜力。”

“在未来，对于脑部遗传病的基因治疗还可以有更多优化选择策略，比如针对需编辑的致病位点多样性而使用编辑范围更广的工具，使用更精准和亲和的递送方式等。除CBE之外，ABE编辑系统以及近期报道的多个基于ABE系统TadA脱氨酶进化得到的新型CBE、CGBE、ACBE等编辑工具均有望在遗传疾病的治疗中得到应用。”北京大学的牛煦然博士和魏文胜教授评论道。

参考文献：

https://www.nature.com/articles/s41593-023-01499-x