中科院1区:泽泻-白术配伍改善脑缺血/再灌注损伤通过靶向SIRT1负调节星形胶质细胞衍生的外泌体miR

【写在前面】：本期推荐的是由福建中医药大学附属康复医院、福建中医药大学康复医学院、福建省康复技术重点实验室-认知康复重点实验室等研究团队合作近期将发表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示泽泻-白术的组合通过靶向SIRT1负调节星形胶质细胞衍生的外泌体miR-200a-3p/141-3p来改善脑缺血/再灌注损伤。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

The combination of Alisma and Atractylodes ameliorates cerebral ischaemia/reperfusion injury by negatively regulating astrocyte-derived exosomal miR-200a-3p/141-3p by targeting SIRT1

民族药理学相关性

泽泻-白术配伍（AA）是一种经典的中药汤剂，可以预防脑缺血/再灌注损伤（CIRI）。然而，根本机制尚未确定。有趣的是，外泌体微小RNA（miRNA）已被认为是中药煎剂药理学中的重要因素。

研究目的

本研究的目的是评估AA的神经保护作用是否依赖于miRNA通过外泌体在大脑中的有效转移。

材料和方法

采用双侧颈总动脉结扎术（BCAL）诱导C57BL/6小鼠短暂性全脑缺血/再灌注（GCI/R）。采用改良神经严重程度评分（mNSS）和Morris水迷宫（MWM）试验评估神经功能缺损。采用蛋白质印迹（WB）法检测SIRT1在大脑皮层的表达。通过WB分析和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫组织化学染色测量磷酸核因子κB（p–NF–κB）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，定量评估炎症状态。免疫组织化学染色检测闭塞带-1（ZO-1）、闭塞素、caudin-5和CD31的蛋白表达，以确定血脑屏障（BBB）的通透性。通过超速离心从脑间质中提取外泌体，并通过透射电子显微镜（TEM）、WB分析和纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行鉴定。外泌体的起源是通过实时定量PCR（RT-qPCR）测量外泌体中的特异性信使核糖核酸来阐明的。外泌体中的差异miRNA使用微阵列筛选进行鉴定，并通过RT-qPCR进行验证。用荧光染料（PKH26）标记外泌体并与bEnd.3细胞孵育，收集上清液，用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定IL-1β/TNF-α的表达，提取总RNA，并用RT-qPCR检测miR-200a-3p/141-3p的表达。此外，对氧-葡萄糖剥夺/复氧（OGD/R）诱导的bEnd.3细胞中miR-200a-3p/141-3p的水平进行了定量。miR-200a-3p/141-3p与SIRT1 3′非翻译区（3′UTR）之间的直接相互作用是通过测定用miR-200a-3p/141-3p模拟物/抑制剂转染的bEnd.3细胞中SIRT1的表达来测量的。

结果

AA治疗显著改善了GCI/R引起的小鼠严重神经功能缺损和记忆丧失，特别是在AA中剂量组。此外，与未治疗的GCI/R诱导小鼠相比，AA处理的GCI/R-诱导小鼠的SIRT1、ZO-1、occludin、caudin-5和CD31表达水平显著增加，p–NF–κB、IL-1β、TNF-α和GFAP表达水平降低。此外，我们发现miR-200a-3p/141-3p在GCI/R诱导的小鼠星形胶质细胞衍生的外泌体中富集，并且可以通过中等剂量的AA治疗来抑制。外泌体介导miR-200a-3p/141-3p转移到bEnd.3细胞中，促进IL-1β和TNF-α的释放，并下调SIRT1的表达。在OGD/R诱导的bEnd.3细胞中未观察到miR-200a-3p/141-3p水平的显著变化。miR-200a-3p/141-3p模拟物/抑制剂分别降低/增加了bEnd.3细胞中SIRT1的表达。

结论

我们的研究结果表明，AA通过靶向SIRT1基因抑制星形胶质细胞衍生的外泌体miR-200a-3p/141-3p来减轻炎症介导的CIRI，这为AA的神经保护作用提供了进一步的证据并确定了一种新的调节机制。

图文摘要

【前言】

缺血性中风是全球成年人道德和永久残疾的主要原因之一，威胁着公共健康。缺血性卒中的发生归因于血管堵塞导致脑血流受阻，导致葡萄糖和氧气供应不足。然而，脑缺血后血液供应的恢复进一步加剧了对脑细胞的损伤，称为CIRI。CIRI由脑缺血和再通引起，涉及一系列生理和病理事件，包括神经炎症、氧化应激和细胞凋亡，导致血脑屏障破坏、脑组织损伤和神经功能缺损。尽管经过几十年的医学研究和现有疗法的重大进展，CIRI的治疗仍然有限。因此，有必要寻找一种有效的方法来改善脑缺血再灌注，治疗缺血性脑卒中。

中药制剂、中药及其活性化合物有可能通过抑制炎症来改善CIRI诱导的血脑屏障破坏。泽泻汤是张仲景在《金堂要略》中首次描述的一种经典中药汤剂，泽泻和白术联合（药对）治疗脑灌注减少引起的头晕已有1300多年的历史。AA由两种中草药组成：泽泻（泽泻的干燥根和根状茎）和白术（白术的干燥根状茎）。AA的化学成分由天津市中药饮片加工技术企业重点实验室采用高效液相色谱法（HPLC）测定（附加文件：AA的HPLC）。

【结果部分】

1.AA改善GCI/R诱导小鼠的神经功能缺损和认知能力下降。

2.AA改善GCI/R诱导小鼠血脑屏障功能障碍。

3.AA通过SIRT1介导的炎症抑制对GCI/R诱导的小鼠血脑屏障功能障碍发挥神经保护作用。

4.星形胶质细胞来源的外泌体的分离与鉴定。

5.AA通过星形胶质细胞来源的外泌体对bEnd.3细胞产生抗炎作用。

6.MiR-200a-3p/141-3p/140-3p/34c-5p在CIRI诱导的星形胶质细胞衍生的外泌体中富集。

7.AA通过星形胶质细胞衍生的外泌体miR-200a-3p/141-3p靶向bEnd.3细胞中的SIRT1发挥抗炎作用。

8.MiR-200a-3p/141-3p而不是MiR-140-3p/34c-5p可以靶向bEnd.3细胞中的SIRT1。

【结论与讨论】

总之，我们的研究表明，AA可能通过抑制星形胶质细胞衍生的外泌体中miR-200a-3p/141-3p的表达而在CIRI中起到神经保护因子的作用，外泌体被BMEC内吞以调节SIRT1降解及其抗炎作用。然而，AA调节星形胶质细胞来源的外泌体分泌的潜在生理机制尚不清楚。此外，关于AA中哪些主要活性成分可以穿过血脑屏障并发挥关键药理作用，目前还知之甚少。因此，在未来的研究中，体外和体内实验将用于鉴定AA中的主要活性成分及其靶标，并探索主要活性成分调节星形胶质细胞来源的外泌体分泌的潜在分子机制。

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