华氏巨球蛋白血症诊断共识发布，涵盖这几大亮点！

华氏巨球蛋白血症（WM）是一种IgM相关淋巴浆细胞性淋巴瘤，疾病的不同临床表现为诊断带来挑战。近年来WM诊断方面取得了显著进展，包括疾病生物学的深入理解以及越来越多的工具和技术。本文介绍华氏巨球蛋白血症欧洲联盟（ECWM）制定的WM诊断共识推荐和实验室要求，供临床实践和研究参考。

WM诊断临床和病理标准

骨髓（BM）活检证实克隆性淋巴浆细胞样细胞（淋巴浆细胞性淋巴瘤），血清存在单克隆IgM，无论M蛋白大小。2016年WHO分类定义IgM型意义未明的单克隆免疫球蛋白血症（IgM-MGUS），即血清中的IgM型M蛋白低于30g/L、BM淋巴浆细胞性浸润＜10%、无淋巴增殖性疾病相关的终末器官损害。
在鉴别诊断WM、IgM-MGUS和其他B细胞淋巴增殖性疾病（B-LPDs）时，仍然必须进行BM活检。本共识聚焦于确定IgM单克隆蛋白和/或初始症状后应采取的实验室检查步骤。
表1 华氏巨球蛋白血症（WM）的分类和相关异常

IgM-MGUS IgM型意义未明的单克隆免疫球蛋白血症，WM华氏巨球蛋白血症。

1. a专家组认为定义IgM水平以区分MGUS和WM是不合适的。然而应该注意的是，在MGUS中IgM水平很少（若有）超过30g/dl。
   
2. b有明确淋巴浆细胞性淋巴瘤BM浸润的患者被认为是WM，没有浸润证据的患者被认为是MGUS。然而在一些患者中可以看到骨髓浸润的不明确证据。这可能表现在几个方面，包括流式细胞术或PCR检测出克隆性B细胞但没有骨髓浸润的形态学证据。另外患者可能有不明确的骨髓浸润而没有证实性的表型。有观点认为这些患者应被分类为MGUS，直到有进一步证据支持。根据2016年WHO分类，IgM-MGUS的骨髓淋巴细胞浸润＜10%。
   
3. c肿瘤浸润引起的症状包括以下任何表现：体质性症状、血细胞减少或器官肿大。

4. d需要存在一组或两组症状。
   
5. e众所周知有部分患者存在IgM单克隆蛋白引起的症状但没有明显的淋巴瘤证据。这类患者可能表现为有症状冷球蛋白血症、淀粉样变性或自身免疫现象，例如周围和冷凝集素病。将这类患者考虑为临床上不同的群体是合适的，推荐使用“IgM相关疾病”这一术语。

▌WM基本实验室分析：常规推荐WM诊断所需样本的质量和数量是关键。目前，BM和外周血（PB）样本均有帮助，而其他组织[淋巴结、胸腔积液、脑脊液（CSF）]可能有助于进一步确定疾病特征。然而，WM的诊断标准仍然需要对BM活检进行组织学评估，以做出最终诊断。▌样本和处理
骨髓活检：包含骨髓结构最小长度为20mm的骨髓活检足以进行WM/LPL的组织病理学诊断。福尔马林固定和EDTA脱钙可为形态学、免疫组织化学和分子学检查提供最佳结果，而其他固定剂和酸性脱钙法会严重影响抗原表达和DNA保存。
骨髓穿刺：应收集有代表性的样本以便对淋巴浆细胞性细胞和浆细胞进行正确的初步细胞形态学评价。对于标准基线分析，至少应将样本收集在三个EDTA管用于MFC和分子学分析，并收集一个肝素钠管用于FISH检查。
外周血在BM不易取样时，一些罕见的白血病WM病例中，PB样本可作为诊断的替代品。全血细胞可用于MFC分析和基因组研究。首选EDTA样本（2管10mL），以便进行CD19+细胞富集。
脑脊液（CSF）：对于疑似宾尼尔综合征（Bing Neel Syndrome）的病例，CSF分析应包括细胞学评估、流式细胞仪、MYD88检测和免疫球蛋白基因重排分析，以及常规的生化和MFC白细胞计数。必须同时进行PB的MYD88检测或流式细胞术红细胞定量，以排除CSF的PB污染。
多参数流式细胞术：大约需要4毫升EDTA抗凝的BM穿刺样本。利用不同的流式抗体组合，通过直接免疫荧光染色和裂解技术进行免疫表型分析。
表2 用于诊断华氏巨球蛋白血症（WM）流式细胞术细胞表征的最小组合

遗传学分析：建议将样本送到参比实验室以确保敏感性和可重复性。但是，也建议非参比实验室对BM样本进行MYD88突变筛选以达到诊断的目的。WM患者中也存在非L265P的MYD88突变，包括S219C、M232T和S243N。下一代测序（NGS）和Sanger测序可用于检测L265P位点以外的MYD88突变。但是NGS尚未普及，而Sanger测序通常未达到最优灵敏度特别是未富集CD19+细胞的样本。此外，这些工具的应用会受到时间、成本、样品质量和BM浸润的限制。PCR分析（ASqPCR，dPCR）比测序技术更适合用于MYD88L265P检测，灵敏度更高、耗时更短、成本更低。对参比实验室的要求细胞遗传学和FISH分析：WM中传统细胞遗传学的作用未得到明确界定，因此不建议对这些患者进行标准核型分析，尽管它可能有助于鉴别诊断，特别是无MYD88L265P突变的病例。对CD19+细胞进行FISH检测比较可行。推荐至少在中心实验室进行del6q和del17p分析。CD19+富集的样本也可使用SNP阵列或全基因组测序等作为备选方法，但还不能考虑用于日常实验室。基因突变研究MYD88L265P检测对中心实验室的主要要求是能通过分子学技术分析MYD88L265P，检测限至少为1×10-3。重复性和敏感性方面，公认的技术包括对未分选的BM样本进行ASqPCR和dPCR，以及对CD19+分选的BM细胞进行Sanger或NGS测序。对于MYD88L265P阴性的ASqPCR检测结果，应进行完整的基因测序寻找非L265P突变，CD19+富集的细胞样本进行Sanger或NGS测序能提供可靠的结果。
CXCR4WHIM检测中心实验室也需要进行CXCR4突变检测。最初并不推荐所有WM患者在初始诊断时进行，但由于BTKi在临床上的广泛使用，其重要性正在迅速显现。多数人推荐在BTKi治疗前或在缓解不佳或疾病进展时进行CXCR4突变筛查，也可以在初始诊断时进行。
其他：研究性分子工具在WM分子研究中，“液体活检”即检测血浆或其他生物体液中的ctDNA，是一种创伤小、对患者友好的检测，可以提供良好的诊断结果甚至与BM相媲美。WM患者PB的ctDNA中MYD88和CXCR4体细胞突变检测正处于发展阶段，与肿瘤负荷存在一致性。而dPCR的使用比qPCR具有实践优势，特别是ctDNA微小疾病残留研究。
竞争性等位基因特异性TaqMan®PCR（Cast-PCR）具有高度特异性和敏感性，可以在含有大量野生型DNA的样品中检测出少量突变DNA，已被用于检测肿瘤来源的DNA和ctDNA中的MYD88L265P突变。所有这些技术都需要在前瞻性研究中进行标准化后才能用于临床实践。目前关于BM穿刺样本MFC和分子学分析的推荐仍被保留。CD19+分选细胞中TP53突变的分析处于研究中，其他突变分析也可根据医生的建议进行。
表3 下一代测序（NGS）中的华氏巨球蛋白血症（WM）患者体细胞基因突变频率

NA不适用

总结

对疑似新诊断WM患者应进行的检查包括病理、MFC和分子学检查，参阅下表总结。
表4 对疑似新诊断的华氏巨球蛋白血症（WM）患者的检查推荐