Science | 法国IPS2 Abdel团队揭示植物性别决定与两性花发育调控新机制

被子植物通常产生两性花。植物为了增加后代的遗传多样性，进化出了几种防止自花受精的系统，比如性别分化。具有性别分化的植物，可以产生雌雄异花同株、雌雄异株等不同类型。从雌雄同体的两性花进化到单性花的过程，由性别决定基因控制。花性的控制对于农业育种与生产有重要意义，比如F1 杂交制种和雌雄异株作物的果实生产。

葫芦科中存在大量雌雄同株或雌雄异株的物种，因此是研究性别分化的良好植物模型。在甜瓜中，花在早期发育阶段是两性的，然后雄蕊或心皮原基的发育停滞导致了性别决定，从而产生单性花。在葫芦科植物的性别决定过程中，雌雄同株为野生型，雄全同株andromonoecious (M)、全雄株androecious (A) 和全雌株gynoecious (G) 基因分别编码 CmACS-7、CmACS11 和 CmWIP1。M、A 和 G 基因的相互作用产生了不同的性别类型，但性别决定基因与两性花发育之间的关系，仍然是个未解之谜。

A melon vine with male (top) and female (bottom) flowers, both of which begin as bisexual buds (PHOTO: ZHANG ET AL.)

2022年11月4日，巴黎萨克雷大学巴黎萨克雷植物研究所（Institute of Plant Sciences Paris-Saclay, IPS2）Abdelhafid Bendahmane团队在国际权威学术期刊Science发表了题为The control of carpel determinacy pathway leads to sex determination in cucurbits的研究论文（张斯淇和谭丰全博士为论文的共同第一作者），揭开了性别决定与两性花发育调控的奥秘。

研究人员在甜瓜中分离了一个雌性到雄性的性别转变突变体，并通过遗传定位将该突变鉴定为心皮发育基因CRABS CLAW(CRC)。通过病毒诱导基因沉默（VIGS）、NGS-TILLING（基于二代测序的靶向诱导的基因组局部病变）技术对该基因进行了验证。通过原位杂交、实时定量PCR等实验发现，CRC的表达受性别决定的雌花基因WIP1的抑制，并且通过遗传学双突变体分析，表明 WIP1 作用于上游，并且在性别决定途径中对 CRC 具有上位性。

为了研究 WIP1 是否为 CRC 表达的直接抑制因子，作者使用 ampDAPseq 绘制了全基因组 WIP1 的DNA 结合图。发现CmCRC 启动子具有CmWIP1结合峰，该结合峰具有保守的WIP motif，但CmCRC 启动子无法被WIP1突变体蛋白 G242R 和 S306F 结合。作者还使用了电泳迁移率变动分析 (EMSA)，ChIP-qPCR，荧光素酶报告系统等进一步验证CmWIP1 蛋白与 CRC 启动子结合，且其结合抑制了CRC基因的表达。

为了揭示 WIP1 介导的 CRC 转录抑制的分子机制，作者使用酵母双杂交系统筛选了 WIP1 的伴侣蛋白，发现WIP1与辅助抑制蛋白TPL结合。进一步研究发现该物理互作涉及 CmWIP1 的 N 端结构域和 TPL 的 LisH、CTLH 和 CRA 结构域。WIP1 N末端结构域包含两个保守motif N1 和 N2。三维结构模型预测 N1 和 N2可能形成一个茎环结构，与招募 TPL 的相互作用有关。作者发现单个 n1 和 n2 突变体部分影响了相互作用，而 n1-n2 双突变体则完全失去互作。通过在甜瓜原生质体中瞬时表达与免疫共沉淀 (Co-IP)实验 ，进一步验证了WIP1和TPL互作。同时发现表达WIP1 的 n1 或 n2 突变蛋白时 pCRC:LUC 报告基因活性显着恢复，表明WIP1通过N1和N2 motif与TPL结合抑制 CRC 表达。

为了验证 WIP1-TPL 相互作用在 CRC 抑制中的生物学相关性，对TPL进行VIGS后植株的雄花部分雌性化，甚至出现完全由雄性向雌性转变。使用NGS-TILLING筛选到的TPL 功能完全丧失突变体无法开花。因此作者对单氨基酸错义突变体进行了表型分析，发现了 4 个突变体会导致30% 到 40%在本该发育雄花的位置上发育出了雌花。WIP1-TPL 相互作用涉及 WIP1 的 N1 和 N2 基序，作者也筛选了这两个基序中的TILLING突变体，并观察到它们出现了雌性化特征，例如在被雄性的花朵中出现了柱头和有胚珠的子房。而且在WIP1 n1 和 n2 突变体中 CRC 的表达抑制被解除。由于前人已报道 TPL 招募组蛋白去乙酰化酶来抑制靶基因的表达，作者因此分析了雄花和雌花中 CRC 的组蛋白乙酰化水平，与雌花相比，雄花中CRC基因区H3K9ac 显着降低。因此，WIP1-TPL 复合物与 CRC 的启动子结合并对其基因区组蛋白去乙酰化以抑制其基因表达，从而促进雄花发育。

花器官中干细胞终止是心皮发育的先决条件。作者通过原位杂交检测了性别转变阶段WUS在雄花和雌花中的表达。在雌花的第 6 阶段未检测到 WUS mRNA，但同一阶段雄花的心皮原基中的 WUS mRNA 水平非常高。对同时期雄花和雌花的心皮原基进行激光显微切割，并通过 qRT-PCR 分析了 WUS 的表达，发现WUS 在雄花与雌花心皮原基中的表达量增加了3倍。在拟南芥中，CRC 通过上调 YUC4 和下调 TRN2 来抑制 WUS 表达。相似的，雌花中显微切割的心皮和雄花中的相比，3 个YUC 基因上调表达而 TRN2 下调表达了。总之，这些结果表明CmWIP1促进雄花发育，是通过抑制CRC表达，从而干扰心皮原基中花分生组织决定。

WIP1-TPL促进雄花发育的模式图

继2009年发现CmWIP1是雌性决定基因后，该研究首次揭示了CmWIP1的转录调控机理与表观调控机制，并回答了关于性别决定与经典两性花发育之间关系这个悬而未决的问题，与ACS乙烯合成基因通路调控雄蕊发育一起，完善了葫芦科作物性别决定的基因调控网络。

法国国家农业食品环境研究院（INRAE）、法国国家科学研究中心（CNRS）、巴黎萨克雷大学巴黎萨克雷植物研究所资深研究员Abdel Bendahmane博士为该论文的通讯作者，博士后张斯淇、谭丰全为本文的共同第一作者。巴黎萨克雷大学Moussa BENHAMED 教授也参与了此项研究。此项研究受到欧洲研究委员会ERC、法国国家科研署ANR等项目支持。

值得一提的是，Abdel Bendahmane团队长期从事植物性别决定的相关研究，破解鉴定了葫芦科作物性别决定的关键基因CmACS-7、CmWIP1和CmACS11等，取得了一系列重要的研究成果，是植物发育领域的权威专家（Science 2008，Nature 2009，Science 2015）。

Boualem, A., Fergany, M., Fernandez, R., Troadec, C., Martin, A., Morin, H., ... & Bendahmane, A. (2008). A conserved mutation in an ethylene biosynthesis enzyme leads to andromonoecy in melons. Science, 321(5890), 836-838.

Martin, A., Troadec, C., Boualem, A., Rajab, M., Fernandez, R., Morin, H., ... & Bendahmane, A. (2009). A transposon-induced epigenetic change leads to sex determination in melon. Nature, 461(7267), 1135-1138.

Boualem, A., Troadec, C., Camps, C., Lemhemdi, A., Morin, H., Sari, M. A., ... & Bendahmane, A. (2015). A cucurbit androecy gene reveals how unisexual flowers develop and dioecy emerges. Science, 350(6261), 688-691.

论文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.add4250