潘多加课题组揭示Hippo信号通路上游调控的新机制

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Hippo信号通路（Hippo signaling pathway）是率先在模式动物果蝇里通过遗传筛选而鉴定出来的一条发育信号通路，其在组织生长调控、组织稳态（tissue homeostasis）维持以及再生修复等过程中均扮演重要角色。Hippo信号通路失调会导致包括癌症在内的多种疾病发生。经典发育信号通路，如WNT，Hedgehog，TGFβ信号通路，都由特异的配体来调控，并以各自的配体来命名。而Hippo信号通路至今没有发现特异的配体，以通路中的一个关键激酶Hippo来命名的。Hippo信号通路能响应多种不同信号，比如细胞接触抑制（cell-cell contact inhibition），细胞粘着连接（adherens junctions），细胞顶端-基底极性（apical-basal polarity），机械力（mechanical forces），渗透压应激（osmotic stress）等等。目前的理论认为，Hippo信号通路响应各种不同信号的这种能力与其在组织生长控制中的关键作用有关，因为这些信号可以从不同的角度来反映动物组织生长状态，并通过Hippo信号通路来精确调控组织生长。比如组织损伤会导致细胞粘着连接受损，而细胞粘着连接受损会下调Hippo信号通路，从而促进组织生长来修复组织损伤。Hippo信号通路如何能够整合众多不同信号目前仍不清楚。

2022年10月31日，美国德克萨斯大学西南医学中心的潘多加教授课题组在Cell在线发表了题为Multiphase coalescence mediates Hippo pathway activation的研究论文，阐述了Hippo信号通路上游调控蛋白AMOT，KIBRA以及SLMAP通过液-液相分离（LLPS）以及多相合并（multiphase coalescence）激活Hippo信号通路的新机制，并提出该机制可能在Hippo信号通路整合多种不同信号中扮演重要角色。

为了研究上游调控蛋白AMOT如何介导细胞接触抑制激活Hippo信号通路，作者首先比较了在低细胞密度和高细胞密度状态下，青色荧光蛋白（CFP）标记的AMOT（CFP-AMOT）在MDCK细胞内的亚细胞定位。结果发现在低细胞密度状态下，CFP-AMOT和细胞内的丝状肌动蛋白（F-actin）结合；而在高细胞密度状态下，F-actin水平显著下降，CFP-AMOT形成聚集体。这些CFP-AMOT凝聚体在光漂白后能快速恢复荧光信号，并且能彼此合并成一个更大的聚集体，表明它们是通过LLPS形成的生物分子凝聚体（Biomolecular condensates）。为了进一步证实AMOT的LLPS，作者在细菌里表达纯化了CFP-AMOT，发现纯化的重组CFP-AMOT蛋白在体外也能通过LLPS 形成液滴状凝聚体。如果在体外重构系统里加入F-actin，CFP-AMOT会选择结合F-actin而不是形成凝聚体。有趣的是，不能结合F-actin的CFP-AMOT突变体在有F-actin存在的情况下依然能形成凝聚体。这些结果表明F-actin通过结合AMOT来抑制AMOT的LLPS。进一步研究发现AMOT的LLPS是由其α-螺旋卷曲螺旋（coiled-coils）介导的，并且AMOT凝聚体可以聚集Hippo信号通路关键激酶MST，LATS以及底物YAP来促进Hippo信号激活。这些结果表明细胞接触抑制可能通过降低F-actin水平来促进AMOT的LLPS，从而激活Hippo信号通路。

多个Hippo信号通路的上游调控蛋白都带有coiled-coils，包括KIBRA和SLMAP。其中KIBRA和AMOT一样激活Hippo信号通路，相反SLMAP直接结合激酶MST并通过SIKE蛋白来招募一个叫做STRIPAK的去磷酸化酶复合物来抑制MST的激酶活性，从而抑制Hippo信号通路。体外重构实验发现KIBRA 和SLMAP也能进行LLPS而形成生物分子凝聚体。KIBRA凝聚体能聚集Hippo信号通路关键激酶MST和LATS来激活Hippo信号，而SLMAP凝聚体能聚集MST和SIKE来抑制Hippo信号。以前的研究结果表明KIBRA既能结合AMOT，也能结合SLMAP。相互作用的LLPS蛋白通常会进行共相分离（co-phase separation）而形成一个凝聚体。在体外重建体系中，KIBRA和AMOT蛋白混合物确实会进行共相分离行成一个包含有二者的AMOT/KIBRA凝聚体，并且事先形成的AMOT凝聚体和KIBRA凝聚体也能合并成AMOT/KIBRA凝聚体。但是KIBRA和SLMAP蛋白混合物并不能进行共相分离，而是形成嵌合的KIBRA-SLMAP二相凝聚体（biphasic condensates）。有趣的是，加入AMOT能促进KIBRA-SLMAP二相凝聚体合并成一个相（AMOT/KIBRA/SLMAP凝聚体）。

图1. AMOT促进KIBRA-SLMAP二相凝聚体合并成一个相

接下来，作者验证了体外重构实验中观察到的现象是否也存在于细胞内。作者发现和AMOT一样，细胞接触抑制同样能诱导细胞内的KIBRA形成凝聚体。此外作者还发现渗透压应激也能诱导细胞内的KIBRA形成凝聚体。无论哪种情况下，KIBRA凝聚体内都包含有AMOT蛋白，表明在细胞内KIBRA凝聚体和AMOT 凝聚体也能合并成AMOT/KIBRA凝聚体。与之对应的是细胞内SLMAP在未受激状态下就能进行LLPS形成凝聚体。进一步研究发现30 分钟渗透压应激诱导形成的KIBRA凝聚体大多紧挨SLMAP凝聚体形成KIBRA-SLMAP二相凝聚体。有趣的是，延长渗透压应激至90分钟会导致一部分KIBRA凝聚体和SLMAP凝聚体合并成一个凝聚体，并且这些凝聚体也包含有AMOT 。这些结果表明在细胞内，KIBRA凝聚体在AMOT的帮助下也能和SLMAP凝聚体合并形成AMOT/KIBRA/SLMAP凝聚体。同样，细胞接触抑制也能导致KIBRA凝聚体和SLMAP凝聚体合并成AMOT/KIBRA/SLMAP的凝聚体。相较单纯的SLMAP凝聚体富集MST和SIKE， AMOT/KIBRA/SLMAP凝聚体能富集MST，LATS和YAP但不能富集SIKE。因此，多相合并形成的AMOT/KIBRA/SLMAP凝聚体可能通过富集MST，LATS和YAP，并排除SIKE来阻止SLMAP凝聚体招募STRIPAK去磷酸酶复合物，从而达到抑制SLMAP凝聚体并激活Hippo信号通路的目的。以往对于LLPS的研究表明凝聚体溶解是抑制凝聚体活性的一个关键机制，而此项工作发现在不溶解凝聚体的前提下，通过多相合并也可以抑制凝聚体活性。

图2. （上）上游调控蛋白通过液-液相分离和多相合并介导Hippo信号通路激活

（下）凝聚体溶解和多相合并皆可抑制凝聚体活性

德克萨斯大学西南医学中心生理学系主任兼HHMI研究员潘多加教授以及助理教授郑勇刚博士为该论文共同通讯作者，博士研究生王力为第一作者，分子生物学系的张瑞辉博士和陈晖教授对本研究提供了大量帮助。潘多加教授实验室多年来一直综合利用果蝇遗传学筛选和小鼠模型来探索动物组织生长控制机制及其在癌症发生中的作用，实验室目前课题除Hippo信号通路之外还包括新发现的生长调控基因。欢迎感兴趣的同学联系潘教授从事博士后研究（实验室主页: https://labs.utsouthwestern.edu/pan-lab）。

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https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.09.036

制版人：十一

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