清华大学饶燏团队最新综述：PROTAC理性设计的九大要点

蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）技术是一种利用化学小分子诱导靶蛋白泛素化标记后经蛋白酶体降解的新型治疗策略。由于PROTAC技术可以降解“不可成药”靶点，这一技术受到了学术界和工业界的广泛关注。然而，PROTAC的设计和优化仍需要基于经验主义的反复迭代优化，这种开发策略存在严重的局限性。

8月2日，清华大学饶燏教授团队在Chemical Society Reviews杂志上在线发表了题为“Chemistries of bifunctional PROTAC degraders”的重磅文章，综述了PROTAC开发过程中的代表性示例，汇总了该领域的重要研发进展，全面系统地从化学角度介绍了PROTAC开发和设计的经验，希望可以帮助提高此类蛋白降解剂的开发效率。全文共49页，内容丰实，以下摘编部分重要内容：

来源：Chemical Society Reviews

一、E3连接酶配体的设计与优化

1.基于多肽的PROTAC

首个PROTAC的E3连接酶配体是IkBα磷酸肽，这种基于多肽设计的PROTAC细胞膜通透性差，需要以显微注射的方式进入细胞。同时这种结构容易被磷酸酶水解，稳定性差。因此，基于多肽设计的PROTAC并未得到广泛应用。

基于多肽的PROTAC的设计与优化（来源：Chemical Society Reviews）

2.基于小分子的PROTAC

从PROTAC提出的2001年到2011年这10年期间，PROTAC进展缓慢。随着小分子E3连接酶配体的不断发现，PROTAC发展迅速。目前，已鉴定出600多种人类基因组编码的E3连接酶，但是E3连接酶配体仍局限于结合小鼠双微体基因2蛋白（MDM2）、细胞凋亡抑制蛋白（cIAP）、希佩尔林道蛋白（VHL）和cereblon（CRBN）的化合物。其中，靶向CRBN的ARV-110和ARV-471已进入临床试验。

E3连接酶配体的发现时间（来源：来源：Chemical Society Reviews）

• MDM2：目前发现的MDM2小分子配体结构较大，合成难度高，限制了MDM2在靶向蛋白降解技术中的应用。

• cIAP：由于cIAP配体苯丁亮氨酸及其衍生物苯丁亮氨酸甲酯（MeBS）导致cIAP自泛素化并降解，靶向cIAP的PROTAC分子研究不多。

• VHL：通过构效关系研究发现了理化性质较好的小分子配体VH101和VH298，这类配体结构中保留了关键羟脯氨酸残基，分子量小于400 Da，类药性提高，细胞通透性增强。小分子VHL配体的发展直接促进了靶向VHL PROTAC技术的突破。

• CRBN：研究表明免疫调节类药物沙利度胺及其类似物的戊二酰亚胺结构可以与CRBN结合。鉴于CRBN配体良好的类药性特征，此类配体广泛应用于PROTAC分子的设计与合成。

已报道的用于PROTAC开发的E3连接酶及其配体（来源：Chemical Society Reviews）

近期发现的新兴E3连接酶，如DCAF11、DCAF15和RNF114等应用范围很窄，原因包括（1）其中一些E3连接酶配体来源于天然产物，结构复杂，难以合成和大量使用；（2）基于E3连接酶共价配体设计的PROTAC分子活性低，潜在毒性仍未阐明。此外，不同E3连接酶的降解范围不同：有些靶蛋白可用多种E3连接酶标记降解，而有些靶蛋白只有特定的E3连接酶才能发挥活性，原因包括（1）E3连接酶在不同细胞中的表达水平不同；（2）E3连接酶本身的靶蛋白选择性；（3）目前的基于分子轮盘赌的PROTAC开发策略下合成的PROTAC分子数量和类型不够。

因此，在设计后续的PROTAC分子时，CRBN和VHL应成为首选的E3连接酶（作用范围最广）；目前现有的E3连接酶配体无法诱导靶蛋白降解时，可选用新的E3连接酶配体用于设计PROTAC分子，但需要广泛的实验验证。

二、连接基团的设计策略

连接基团的长度、组成、柔性、连接位点对PROTAC活性三元复合物的形成、降解活性和靶标选择性很重要。对于连接基团的设计和优化目前没有普适性的策略，往往是从短小简易的烷烃或聚乙二醇（PEG）链为起点，通过不断尝试调整连接基团的特性。

1.连接基团的结合位点

连接基团与配体结合的原则是不要降低配体与相应受体的亲和力：（1）连接基团不要与配体关键活性位点结合；（2）连接基团可结合到配体的溶剂暴露位点；（3）尽可能保持配体的结构完整性。

（1）E3连接酶配体结合位点的选择

• 避免连接基团与配体关键活性位点结合。

• 连接基团的不同结合位点将导致不同的靶蛋白降解特性。

连接基团的不同结合位点将导致不同的靶蛋白降解特性（来源：Chemical Society Reviews）

（2）靶蛋白配体结合位点的选择

靶蛋白配体结合位点应避免破坏配体与受体的亲和力，如配体结合口袋边缘或溶剂暴露区的NH基团、芳环上的O原子等。

• 大分子抑制剂可在不影响与靶蛋白亲和力的前提下简化结构，获得更适宜的结合位点。

• 共价抑制剂需考虑结构中的丙烯酰胺对结合性能是否必需。

靶蛋白配体的结合位点（来源：Chemical Society Reviews）

2.PROTAC分子的组装

• 可在靶蛋白配体或E3连接酶配体上引入修饰基团后与连接基团结合，利用连接基团上的活性位点组装形成完整的PROTAC分子。

• 靶蛋白配体与E3连接酶配体上分别预先修饰部分连接基团，经化学反应形成完整的连接链，组装成PROTAC分子。

• 由于点击化学的方便性，三唑结构也愈加受到药物化学家的欢迎。三唑基团可以提高PROTAC分子的溶解度与代谢稳定性，可以与POI和E3连接酶中的一些氨基酸残基形成氢键，增强活性三元复合物的相互作用。因此，三唑结构可有效提高PROTAC降解效率。

PROTAC分子的组装（来源：Chemical Society Reviews）

三、典型PROTAC分子的设计

1.亚型选择性PROTAC的设计

• 基于选择性抑制剂开发的蛋白亚型选择性PROTAC分子。

• 基于通用型抑制剂开发的选择性PROTAC分子可以通过（1）给药剂量、（2）连接基团长度和（3）配体修饰获得选择性靶蛋白降解性能。

选择性PROTAC的开发（来源：Chemical Society Reviews）

2.降解蛋白复合物的PROTAC分子

• 降解蛋白复合物的PROTAC分子对蛋白亚基具有高度特异性。

• 此类PROTAC分子对不同亚基的降解程度不同，可能存在另外的降解机制。

靶向EED的PROTAC分子可降解PRC2蛋白复合物（来源：Chemical Society Reviews）

3.以不同的靶蛋白配体设计PROTAC降解相同的靶蛋白

• PROTAC分子降解所需的关键三元复合物中，靶蛋白和E3连接酶间的相互作用对降解可能产生正向或反向影响，改变靶蛋白配体将显著改变PROTAC降解特性。

• 具有不同配体结合口袋和高亲和力小分子抑制剂的靶蛋白可开发出多样化的PROTAC分子，可克服耐药性和不良反应。

降解BCR-ABL蛋白的代表性PROTAC分子（来源：Chemical Society Reviews）

4.降解不可成药靶标的PROTAC分子

• 高亲和力的小分子配体是开发降解不可成药靶标PROTAC分子的关键。

• 需要根据构效关系研究不断优化PROTAC分子结构。

靶向“不可成药”STAT3 SH2 结构域PROTAC分子的设计（来源：Chemical Society Reviews）

四、降解突变蛋白的PROTAC

肿瘤耐药成为临床使用小分子抑制剂进行化疗的难题。为达到强有效的抑制效果，小分子抑制剂需要与靶蛋白在高浓度下长时间相互作用，增加了靶蛋白耐药突变的几率，导致化疗效果下降甚至丧失。而PROTAC“事件驱动”的瞬时作用模式，可以减少或者避免突变。

1.降解野生型和突变型靶蛋白的PROTAC

• 同时降解野生型和突变型靶蛋白的PROTAC需要有可以同时结合两种靶蛋白的配体。

• 对E3连接酶配体、连接基团和E3连接酶种类的优化可以进一步提高PROTAC降解效率。

可同时降解野生型和突变型BTK的PROTAC优化（来源：Chemical Society Reviews）

2.选择性降解突变蛋白的PROTAC

• 开发具有选择性突变蛋白降解活性的PROTAC首先需要开发对突变蛋白具有高亲和力的靶蛋白配体。

• 实现突变选择性靶蛋白降解不依赖于抑制剂和E3连接酶的选择，而是与突变与野生蛋白构象是否促进活性三元复合物形成有关。

  
  

BRAFV600E选择性降解PROTAC的开发（来源：Chemical Society Reviews）

五、共价PROTAC的设计

相对于非公价抑制剂，靶向共价抑制剂（TCI）具有作用时间更长、药效更强的优势。目前，利用 α,β-不饱和羰基化合物（如丙烯酰胺）靶向非催化半胱氨酸残基是TCI开发的主要策略。为了减少丙烯酰胺带来的脱靶效应，开发了更多新的反应性基团来提高TCI的安全性和反应性。

靶蛋白的有效降解需要PROTAC分子与之结合。“无法成药”蛋白很难开发有效的抑制剂，E3连接酶配体的开发也遇到瓶颈。因此，在PROTAC结构中引入亲电基团，使之与靶蛋白或E3连接酶共价结合，可以实现靶蛋白的高效降解。尽管这种作用模式的PROTAC分子失去了催化降解的特征，现有研究表明此类降解剂具有优于非共价PROTAC的独特之处。

1.不可逆共价PROTAC分子

• 与靶蛋白不可逆共价结合的靶蛋白配体可以开发降解“不可成药”蛋白的PROTAC分子。

• 开发共价E3连接酶配体可以提高PROTAC的降解范围。由于CRBN结合是活性三元复合物形成的限速步骤，开发共价E3连接酶可以迅速筛选和识别靶标蛋白；共价结合的E3连接酶-PROTAC复合物可以招募多个靶蛋白泛素化标记后降解，加速了活性三元复合物的形成。

靶向KRASG12C的不可逆共价PROTAC（来源：Chemical Society Reviews）

与E3连接酶不可逆共价结合的PROTAC分子（来源：Chemical Society Reviews）

2.可逆共价PROTAC

• 可逆共价PROTAC是解决不可逆共价PROTAC非催化降解问题的一种解决办法，靶蛋白降解后可逆共价PROTAC可解离、再生。这种作用模式的PROTAC可以增强降解效率、提高选择性、延长作用时间，不影响PROTAC亚化学计量学的作用模式。

降解BTK蛋白的可逆共价PROTAC（来源：Chemical Society Reviews）

六、双机制降解剂的设计

PROTAC和分子胶是两种研究最为广泛的靶向蛋白降解剂。理论上，将两种降解机制融合到一个分子中将发挥更大的临床应用价值。此前的部分研究表明，基于CRBN设计的PROTAC分子同时可以降解目标靶蛋白和E3连接酶配体靶标（如IKZF1/3, CK1a）。

• 基于CRBN开发的PROTAC分子都具有两种潜在的作用机制，可能会同时招募靶蛋白和邻苯二甲酰亚胺类药物底物泛素化降解。

同时具有PROTAC和分子胶作用机制，降解细胞周期G1到S期的转换1（GSPT1）化合物的开发优化过程（来源：Chemical Society Reviews）

七、优化PROTAC药代动力学参数的结构改造

• 具有良好药代动力学参数的PROTAC分子需要不断优化靶蛋白配体与E3连接酶配体种类，修饰分子结构以提高成药性（如降低分子量）和降解活性。

降解AR PROTAC的设计与药代动力学优化过程（来源：Chemical Society Reviews）

八、基于晶体结构和计算化学开发的PROTAC

1.晶体结构指导的理性PROTAC设计

• PROTAC诱导靶蛋白配体和 E3 连接酶配体之间形成三元复合物，这种三元复合物的相互作用可以通过连接基团进行调节。

• 可以利用三元复合物的晶体结构合理开发、修饰PROTAC。

基于三元复合物晶体结构理性设计的降解BRD4的PROTAC分子（来源：Chemical Society Reviews）

2.计算化学指导下的理性PROTAC设计

• 三元复合物形成依赖非共价作用，体积庞大、作用灵活且不稳定，三元复合物晶体构建条件严苛、费时费力，难以满足需求。开发用于三元复合物建模的计算方法迫在眉睫。

• PROTAC的关键挑战在于如何连接靶蛋白配体和E3连接酶配体。直接将PROTAC与每个靶蛋白和E3连接酶对接并叠加对接姿态最为简单实用，但是以不精确的方法评估靶蛋白和E3连接酶间的相互作用也同样重要。

• 人工智能可以进一步利用现有高质量但分散的实验结果，推动理解蛋白-蛋白相互作用的内在机制，促进PROTAC的发展。

基于计算化学开发的PROTAC（来源：Chemical Society Reviews）

九、条件控制的PROTAC设计

目前的PROTAC分子存在可控性差、时空选择性低等缺陷，这将导致无法控制药物的释放，并将导致一些明显的副作用。为了研究PROTAC在生物机体中的作用机制和生理活性，科学家开发了一系列可控性强、高度时空选择性、作用机理简单的PROTAC分子。

• 在PROTAC结构中引入光保护基团（PPG），修饰过的PROTAC分子仅在紫外辐射下脱去PPG才可发挥降解活性。

• 叶酸受体α是肿瘤特异性高表达的受体，PROTAC结构中修饰叶酸可实现肿瘤靶向递送。修饰后的PROTAC分子通过内源性细胞水解酶释放叶酸，PROTAC恢复活性降解靶蛋白。

• 缺氧是许多实体瘤的特征之一，在PROTAC结构中引入缺氧激活的离去基团可实现PROTAC肿瘤特异性靶蛋白降解。

条件控制的PROTAC分子（来源：Chemical Society Reviews）

十、展望

目前，PROTAC的发现过程是经验性的。由于PROTAC优化很难概括系统的构效关系，针对新靶点开发的PROTAC很大程度上依赖于大量的化合物合成。E3连接酶及其配体的发现远远落后于PROTAC分子的开发进度，当前仅VHL和CRBN得以广泛使用。更多E3连接酶及其配体的发现将进一步推动PROTAC的发展。PROTAC活性中间体三元复合物的形成需要与靶蛋白结合力强的小分子抑制剂，而由于“不可成药”靶点（如转录因子、支架蛋白）缺乏高亲和力配体，开发降解此类靶点的PROTAC也十分困难。靶标确定后，结合靶蛋白配体和E3连接酶的连接基团对PROTAC的活性、选择性和药物成药性很关键，需要考虑连接基团的长度、组成、结合位点、柔性和合成难易度。尽管阐明 PROTAC诱导三元复合物的晶体结构可以促进 PROTAC的合理设计，但是这一过程非常困难，开发具有预测功能的新型计算工具将促进PROTAC发展。

总之，PROTAC是一种跨越目前药物研发障碍的强大方法，但未来还需要进一步深入了解PROTAC的临床有效性和安全性。未来需要加强对靶蛋白配体和E3连接酶工具箱的开发，总结PROTAC的开发规律。

参考资料：

[1]Chaoguo Cao et al. Chemistries of bifunctional PROTAC degraders. Chemical Society Reviews. 2022.

[2]宋小莉 et al. 类风湿关节炎滑膜组织中脯氨酸羟化酶及希佩尔林道肿瘤抑制蛋白的表达及意义. 中国组织工程研究. 2019.

[3]柯艺文 et al. 宫颈癌组织中miR-183与GSPT1的表达及临床意义. 临床肿瘤学杂志. 2022.