SARS-CoV-2 NSP5和N通过抑制应激颗粒的形成来抑制RIG-I 信号通路

SARS-CoV-2引起的2019年冠状病毒病(COVID-19)疫情正在全球肆虐，现已造成4.4亿人次感染，597万人死亡（截止2022年3月5日），成为21世界最为严重的流行病病原。天然免疫反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线。SARS-CoV-2感染细胞后，其基因组复制中间体可以激活RIG-I和MDA5识别感受器激活天然免疫信号通路。（antiviral stress granule，avSG）是调控病毒翻译，调控抗病毒天然免疫反应。现已有文献发现，MERS-CoV和传染性支气管炎病毒可以抑制抗病毒应激颗粒avSG的形成，宿主识别。而SARS-CoV-2的核酸是否也就有这种作用，尚不明确。

近日，由山东大学齐鲁医学院高成江教授和王培会教授课题组在Nature旗下期刊Signal Transduction and Targeted Therapy杂志上发表了题为“SARS-CoV-2 NSP5 and N protein counteract the RIG-I signaling pathway by suppressing the formation of stress granules”的研究论文。

首先，作者通过免疫荧光标记观察，发现N蛋白和NSP5蛋白都能抑制抗病毒应激颗粒（antiviral stress granule，avSG）的形成。并且，还发现N蛋白和NSP5蛋白都能促进病毒复制，但这种机制可能是通过avSG形成，进而实现促进病毒复制。

为了验证这个猜想，作者过表达N蛋白和NSP5蛋白，发现都能显著抑制SeV和poly (I:C)诱导I型干扰素和干扰素刺激基因的表达。通过荧光素酶报告基因筛选，确定了NSP5蛋白作用与RIG-I或MDA5识别感受器，而不是下游MAVS、TBK1、IRF3-5D、TRIF或STING等节点。应激颗粒（stress granule，SG）可以直接作用于RIG-I和MDA5识别感受器上游，对RLR信号通路起到正向调节作用。那么，NSP5是否作用于SG，而抑制天然免疫呢？

作者通过免疫共沉淀实验验证了NSP5蛋白与SG成分G3BP1蛋白具有相互作用，这种相互作用不与NSP5蛋白水解酶活性有关。同样也验证了NSP5蛋白与RIG-I和MDA5蛋白也具有相互作用，不与MAVS、TBK1、IRF3相互作用。说明nsp5蛋白作用的节点仅是RIG-I和MDA5蛋白而不是其他蛋白。前期有研究发现，TRIM25蛋白是激活RIG-I关键的E3泛素连接酶，然而nsp5蛋白抑制TRIM25表达，损伤RIG-I-TRIM25相互作用关系。综合上述结果，nsp5蛋白通过抑制avSG形成，阻断RIG-I信号激活，进而阻断RLRs信号通路。

接下来，作者有验证了N蛋白，发现N蛋白抑制RIG-I和G3BP1诱导的IFN-β-Luc、IFN-λ1-Luc和ISRE-Luc的活性。说明了，N蛋白通过靶向上游辅因子而不是直接影响RLR受体来拮抗RLR信号通路。免疫共沉淀实验也验证了G3BP1 蛋白在体外与 N 蛋白存在相互作用，并且N蛋白显著性抑制G3BP1表达，进而抑制了应激颗粒形成。辅助因子PACT蛋白对激活RLR受体识别dsRNA至关重要。作者在存在或不存在PACT和RIG-I的情况下检查N蛋白的抑制效果。发现N蛋白抑制了由RIG-I和PACT诱导的IFN-β-Luc、IFN-λ1-Luc和ISRE-Luc的活性。说明了N蛋白影响一系列RLR辅因子，通过调节avSG的形成来抑制I型和III型IFN的表达。

此外，还验证了N蛋白与PACT、RIG-I和MDA5相互作用，但不与其他信号分子相互作用，同时与NSP5蛋白一样，也能损伤RIG-I-TRIM25相互作用关系抑制RLRs信号通路激活。

在这项研究中，作者发现SARS-CoV-2 NSP5蛋白和N蛋白抑制avSG的形成并抑制了RIG-I/MDA5介导的I型和III型IFN反应。从机制上讲，NSP5蛋白抑制avSG形成不依赖于其水解酶活性，可直接靶向RIG-I并阻碍RIG-I-MAVS相互作用抑制RLRs信号传导。与NSP5相比，N蛋白与G3BP1相互作用，并抑制G3BP1表达阻断SG形成，并阻止RLRs的辅助因子PACT增强RIG-I的活性，从而影响dsRNA传感。这项研究揭示了SARS-CoV-2、应激反应和先天抗病毒免疫之间的密切关联，从而为病毒致病性和治疗提供了见解。

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