在制药过程中，细菌内毒素的检测依赖于鲎血资源。随着注射剂、疫苗类、化学药品类等制剂品的需求不断增长，鲎血资源的使用率越来越高；同时，鲎试剂中含有B因子、C因子、G因子、凝固酶原，存在由1,3-β-D-葡聚糖激活G因子导致的假阳性结果。所以，建立一套不依赖鲎生物进行细菌内毒素检测的快捷、高效的补充替代方法尤为重要。
作为新型的重组鲎试剂检测方法：重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)则备受关注。
一、重组鲎试剂(rCR)和重组C因子(rFC)的概念
01 重组鲎试剂(rCR)
重组鲎试剂(rCR)是一种基因工程技术合成的细菌内毒素定量检测试剂，该试剂不依赖鲎血资源，满足可持续发展的目标。
重组鲎试剂
它完全模拟了天然鲎试剂(LAL)的酶联反应，包含C因子、B因子、凝固酶原，是唯一一种拥有与天然鲎试剂(LAL)相同酶联反应,同时又消除了与1,3-β-D-葡聚糖交叉反应造成假阳性结果的内毒素检测试剂。
重组鲎试剂(rCR)（上图右侧）成功去除了天然鲎试剂（上图左侧）的G因子干扰。
02 重组C因子(rFC)
重组C因子(rFC)是通过体外重组鲎凝血级联反应的第一个组分：C因子，激活的C因子直接剪切一个荧光底物，产生的信号被荧光酶标仪识别。相较于天然鲎试剂(LAL)，重组C因子法只有一种反应机制。
反应机制：左侧为重组鲎试剂 右侧为重组C因子试剂
二、天然鲎试剂(LAL)、重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)对比情况
作为新型的重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)，与天然鲎试剂(LAL)进行细菌内毒素检测时又会有什么不同呢？
01 重组鲎试剂(rCR)与天然鲎试剂(LAL)在检测内毒素上比较
图1
由图1所示，通过研究在显色底物存在下，使用三种重组酶原的多种组合，确定三种重组酶原是否能重建反应步骤。
结果证实，当三种重组酶原同时存在时，内毒素才能激活蛋白酶活性，得出了重组鲎试剂(rCR)与天然鲎试剂(LAL)在检测内毒素上具有等效性。另外，研究证实了，三种重组酶原的蛋白酶活性大大增强，信号放大。
02 天然鲎试剂(LAL)、重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)对内毒素敏感度比较
图2
从反应机制上看，重组C因子(rFC)缺少了级联放大的两个环节（加速反应），只能通过荧光检测人为放大（减少了来源于自然反应的特异性）。
如图2所示，凝血酶的活化是天然鲎试剂(LAL)信号放大的主要驱动力；B因子的活化是针对内毒素的特异性活化，由此可以得出，重组鲎试剂(rCR)敏感度比重组C因子(rFC)更高。
03 重组鲎试剂(rCR)与天然鲎试剂(LAL)检测时间比较
图3
如图3所示，通过对一系列浓度RSE（细菌内毒素参考标准品）应用重组鲎试剂(rCR)和典型动态显色试剂检测得到的起始时间值，得出重组鲎试剂(rCR)较典型的动态显色试剂检测缩短了大约一半的时间。
04 重组鲎试剂(rCR)与天然鲎试剂(LAL)批间一致性比较
图4
天然来源的天然鲎试剂(LAL)试剂具有固定的批次间变异性，而重组鲎试剂(rCR)表现出批次间的一致性。图4所示，六个单独批次的重组鲎试剂(rCR)的曲线标准趋于一致，证明重组鲎试剂(rCR)具有重复性和可预测性的性能。
05 重组鲎试剂(rCR)与天然鲎试剂(LAL)对内毒素特异性比较
图5
图5的X-Y轴分别表示的是加标/不加标1,3-β-D葡聚糖的各批次重组鲎试剂(rCR)和系列标准浓度的反应。结果显示了添加1,3-β-D葡聚糖对应用重组鲎试剂(rCR)对内毒素的检测不存在干扰，各批次间相关性良好。
06 重组鲎试剂(rCR)验证性能
图6
图7
如图6、图7所示，应用重组鲎试剂(rCR)在0.005 -50--EU/mL内毒素范围内，在两批次、四个分析人员、三天内条件下，执行了24个性能验证实验。依据ICH Q2指南标准，结果显示各验证参数满足标准要求。
07 重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)、天然鲎试剂(LAL)针对检测样品的比较
图8
图9
图10
图8、图9、图10所示，适合性/一致性研究测试了多个成品、水、缓冲液等样品，得出重组鲎试剂(rCR)较然鲎试剂(LAL)具有相等或较低的不干扰稀释倍数(NID)。另外，Muroi 等人报告了使用重组鲎试剂(rCR)前身 PyroSmart 试剂检测药典118种肠外注射药物得出了相似的结果。
基于以上数据得出结论，重组鲎试剂方法(rCR)适合于广泛的产品检测。可比性研究测试了多种来源的细菌内毒素和水样，证实应用重组鲎试剂(rCR)检测具有较好的相对回收率。
08 重组鲎试剂(rCR)、天然鲎试剂(LAL)、重组C因子(rFC)方法对比
图11
如图11 所示，重组鲎试剂(rCR)优于重组C因子(rFC)。重组鲎试剂(rCR)检测过程不需要更换方法和设备，就能继续同样的工作流程。
三、总结
从天然鲎试剂(LAL)、重组鲎试剂(rCR)、重组C因子(rFC)对比情况来看，重组鲎试剂(rCR)较重组C因子(rFC)、天然鲎试剂(LAL)在细菌内毒素检测上具有较强的优势：
相比重组C因子(rFC)内毒素检测方法，重组鲎试剂(rCR)可以产生级联放大反应，使得内毒素检测更加高效和灵敏。
文章参考来源：PYROSMART NEXTGEN RECOMBINANT LAL REAGENT
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