王玉龙/张晓明合作揭示甲状腺乳头状癌启动、演进的单细胞图谱

责编 | 酶美

甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid cancer, PTC）是内分泌系统最常见的恶性肿瘤【1】。尽管大多数PTC预后良好，但仍有部分患者的病灶会出现淋巴结转移、远处转移，对放射性碘131治疗产生抵抗，进展为晚期疾病【2, 3】。这些现象都提示，PTC存在着肿瘤间和肿瘤内部异质性，且对疾病转归和治疗策略产生重要影响。

近日，复旦大学附属肿瘤医院头颈外科王玉龙教授与中科院上海生命科学院巴斯德所张晓明教授合作，在Nature Communications 上在线发表了题为 Single-cell transcriptomic analysis of the tumor ecosystems underlying initiation and progression of papillary thyroid carcinoma 的研究论文。该研究通过单细胞测序技术，结合宏观RNA-seq数据，在不同层次分辨率的视角下，全面揭示了甲状腺乳头状癌的单细胞谱系，系统性地解释了甲状腺乳头状癌从肿瘤发生到发展的肿瘤生态系统动态演进过程，并提出潜在的精准治疗策略。

作者首先对来自不同分期且涵盖了经典型和罕见亚型的11位PTC患者的23例样本（包括原发肿瘤、癌旁组织、淋巴结转移灶和远处转移灶）进行了单细胞转录组测序，共捕获到接近16万个细胞的高质量转录组数据，其中包括36,265个甲状腺滤泡上皮细胞。在此基础上，该研究在四个方面做出了较为重要的突破。

首先，开发出适用于PTC的单细胞谱系鉴别流程。PTC肿瘤中的拷贝数变异（copy number variation，CNV）频率较低，仅为30%左右，以往在其他癌症中通过细胞CNV水平区分良恶性细胞的经典方法，在PTC中并不能准确应用【4】。为此，本研究开发出了一套鉴别甲状腺乳头状癌良恶性细胞的综合算法。进一步的机器学习建模显示，本研究建立的良/恶性甲状腺细胞区分方法的灵敏度和特异度均高达95%以上，在方法学上为后续PTC单细胞研究建立了可靠的甲状腺上皮细胞良恶性鉴别流程。

其次，发现了PTC中存在“癌前状态”的甲状腺上皮细胞。作者深入分析测序样本发现，一例右甲癌患者的“癌旁组织（影像学无肿瘤证据的左甲腺叶）”存在一种独特的细胞。这种细胞在病理形态上与正常甲状腺上皮细胞完全相同，但其单细胞转录特征却介于良性和恶性甲状腺上皮细胞之间。更有趣的是，这个术前和术中评估完全正常的“癌旁组织”在显微镜下呈现出多个极其微小的癌灶。拟时序分析发现，这些“癌旁组织”中的隐匿癌灶的转录谱系更接近于其周围的“癌前”细胞，而非右侧甲状腺的原发肿瘤。因此作者推测，左甲的隐匿癌灶可能独立起源于毗邻的癌前细胞，而非右甲癌灶的腺体内播散。看似健康未受累的左侧甲状腺，既是肿瘤发生的“种子”，也是肿瘤生长的“土壤”。这一发现解释了临床上一部分患者行单侧切除后，对侧残留甲状腺内肿瘤再发的原因，也提示了对于一部分具有特殊转录组改变的甲状腺癌患者行全甲状腺切除的必要性。

图1. 左上角的HE染色图片展示了本研究中Case 5的右甲原发癌灶和左甲“癌旁组织”中的隐匿癌灶和其周围的癌前状态甲状腺上皮细胞。左下图和右图展示了Case 5中甲状腺上皮谱系的转录特征差异和拟时序分析的进化路径。

第三，绘制出甲状腺上皮细胞的恶性进化演进路径。作者对所有甲状腺上皮细胞进行拟时序分析并发现，甲状腺上皮细胞根据进化路径可以分为三类：分化良好的甲状腺上皮细胞组成了滤泡样细胞（Follicular-like），但其在恶性演进过程中走向了两种迥然不同的路径，分别演化为部分上皮-间充质转化样细胞（p-EMT-like）和去分化样细胞（Dedifferentiation-like）。这三类细胞在样本类型来源、分化程度上具有极大的差异。更重要的是，通过上述甲状腺上皮细胞演进路径，作者合理地解释了所有11例测序患者的临床特征和疾病动态变化（包括肿瘤临床病理特征、碘治疗敏感/抵抗性等），较为完整的解释了PTC肿瘤细胞层面从发生到发展的动态过程。

图2. 本研究中所有甲状腺上皮细胞谱系的拟时序分析描绘出甲状腺上皮细胞完整的进化路径，并将其分成了三个类别。下面三张箱型图展示了三类甲状腺上皮细胞的TDS、BRAF、RAS评分差异。

第四，完善了PTC的经典分子分型并进行更精准的分类。2014年TCGA官方的Cell文章将PTC分成了BRAF-like和RAS-like两种经典分子分型【4】。而本研究作者通过上述拟时序分析得到的甲状腺上皮谱系特异性基因集，对宏观层面的BRAF-like，RAS-like两种分型进行了合理改良。同时这项研究回答了三个更为细致的问题。① 学界公认BRAF-like型PTC中存在高度异质性，但能否进一步细化分类？② 分子分型产生的内在原因是什么？③ 是否有对应的精准治疗策略？对这三个问题，这项研究给出了答案。在宏观层面上，除了RAS-like型，本文作者进一步将BRAF-like型PTC分成了预后差异显著的BRAF-like-A和BRAF-like-B两类，而RAS-like，BRAF-like-A，BRAF-like-B三大分子分型，恰好对应了前面单细胞层面上滤泡样、p-EMT样、去分化样恶性甲状腺上皮细胞的富集，提示了宏观分子分型的内在成因是由于肿瘤细胞的成分差异导致的。而BRAF-like-B型PTC伴有PD-1通路的激活，部分病例中PD-L1高表达，而后的内皮细胞分析则提示PTC中存在血管-免疫通路交互作用，提示了免疫治疗乃至联合抗血管靶向治疗在这个预后最差的分型中的潜在价值。

综上，该研究通过单细胞测序技术对甲状腺乳头状癌的肿瘤起源、恶性演进过程进行了深度探索，深入揭示了甲状腺乳头状癌的肿瘤异质性，为精准分型基础上的精准治疗提供了新的思路。

图3. 研究概要图。

复旦大学博士后濮伟霖、复旦大学附属肿瘤医院史潇医师、复旦大学附属肿瘤医院博士生于鹏程、中科院上海生命科学院研究助理张美莹为本文共同第一作者。复旦大学附属肿瘤医院头颈外科王玉龙教授、中科院上海生命科学院巴斯德所张晓明教授为本文共同通讯作者。

王玉龙教授依托复旦大学附属肿瘤医院和复旦大学生命科学院，建立了以甲状腺癌和头颈部鳞癌为主要研究对象的研究团队，课题组与复旦大学生命科学院、复旦大学生物医学研究院、中科院上海生命科学院等单位保持紧密的合作关系。王玉龙教授和王久存教授长期招收联合培养博士后，欢迎具有肿瘤学、生物信息学、免疫学和实验动物相关研究背景的研究人员申请。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-021-26343-3

制版人：十一

参考文献

1. Lim, H., et al., Trends in Thyroid Cancer Incidence and Mortality in the United States, 1974-2013. JAMA, 2017. 317(13): p. 1338-1348.

2. Tiedje, V. and J.A. Fagin, Therapeutic breakthroughs for metastatic thyroid cancer. Nat Rev Endocrinol, 2020. 16(2): p. 77-78.

3. Mehnert, J.M., et al., Safety and antitumor activity of the anti-PD-1 antibody pembrolizumab in patients with advanced, PD-L1-positive papillary or follicular thyroid cancer. BMC Cancer, 2019. 19(1): p. 196.

4. Cancer Genome Atlas Research, N., Integrated genomic characterization of papillary thyroid carcinoma. Cell, 2014. 159(3): p. 676-90.

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