腌制臭鸡蛋中微生物多样性分析及关键物质含量测定

臭鸡蛋蛋体呈灰白色，有淡淡的臭味，入口后酯香浓郁、余味悠长。当前，臭鸡蛋生产仍以家庭生产方式进行，产品质量不稳定，其关键原因是臭鸡蛋中的微生物菌落结构信息不详。因此，探究臭鸡蛋中微生物群落结构、微生物群落结构与化学特性的关系十分重要。中国传统发酵食品种类众多且大多采用独特的生产方法，涉及复杂的微生物群落，采用传统的培养方法对它们进行分析显然已经远无法满足研究的需要。近年来，高通量测序以其检测快速、准确、信息全面丰富等优点，被广泛应用于发酵食品微生物多样性的研究。

发酵食品在生产的过程中，微生物将对原材料中的物质进行降解、转换及分泌自身代谢产物等物质，而这些物质会对产品的风味、营养及安全性造成一定的影响。如传统发酵食品中普遍存在生物胺，尤其是原料富含蛋白质的传统发酵食品。食用过多含有生物胺的食物，可能会引起中毒，导致偏头疼、高血压、呼吸紊乱等不良反应。鸡蛋中富含胆固醇等脂类及氨基酸，会对产品的风味及营养价值造成很大影响，而到目前为止，鲜有臭鸡蛋中上述物质含量相关的报道。

河北农业大学食品科技学院陈伟、卢海强*和河北农业大学教务处的李杨等人以传统腌制臭鸡蛋为材料，开展微生物（细菌和真菌）多样性及氨基酸、生物胺与胆固醇等物质含量分析，以加深对臭鸡蛋中微生物多样性及其化学特征的认识，强化臭鸡蛋的质量与安全，提高臭鸡蛋的品质，为优化和规范臭鸡蛋的标准化生产提供科学依据。

1 微生物多样性分析

1.1 微生物的α多样性分析

基因组DNA PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳检测（图1），并对目标片段进行切胶回收，回收浓度到扩增的要求，可用于后续的研究分析。通过细菌V3-V4和真菌ITS1测序，分别获得66 229 个和94 033 个序列。运用QIIME软件和R软件剔除疑问序列并统计序列数，分别获得39 605 个和53 649 个序列。所得序列在97%的相似水平下进行OTU统计分析，分别获得2 748 个和712 个OTU。

结果显示，臭鸡蛋卤汁样品中细菌和真菌的微生物群落种群多样性和总体丰度相对较高。从Chao1指数和ACE指数可以看出，臭鸡蛋卤汁样品中细菌的群落丰度高于真菌。在采样数量不足5 000 个OTU时，细菌与真菌的Shannon指数便进入了平台期，表明测序结果已足够反映臭鸡蛋卤汁样本所包含的多样性，臭鸡蛋样品的测序深度已满足后续生物信息学分析的要求。

1.2 臭鸡蛋卤汁样品中不同水平细菌群落组成分析

臭鸡蛋卤汁样品中共鉴定出7 个细菌门，分别为变形菌门（Proteobacteria）、盐厌氧菌门（Halanaerobiaeota）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）。

由图2A可知，盐厌氧菌是卤汁的细菌中最占优势的菌群，由门水平至属水平其相对丰度均在53%以上；Proteobacteria和Firmicutes所占比例略低，相对丰度分别为30.62%和15.05%。在变形菌门中γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）为优势菌纲，其相对丰度为30.26%。γ-变形菌纲中有很多病原菌，如沙门氏菌属和弧菌属等，在腌制臭鸡蛋的过程中控制变形菌的生长，利于提高臭鸡蛋的安全性。在厚壁菌门中芽孢杆菌纲（Bacilli）和梭菌纲（Clostridia）占主导地位，相对丰度分别为7.56%和7.48%。

臭鸡蛋卤汁中鉴定出的细菌属主要有2 0 个（图2 B）。在这2 0 个细菌属中，嗜盐耐盐的菌属有盐厌氧菌属（Halanaerobium）、盐单胞菌属（Halomonas）、源洋菌属（Idiomarina）、盐乳芽孢杆菌属（Halolactibacillus）、海杆菌属（Marinobacter）、Kosakonia、嗜盐嗜碱菌属（Alkalibacterium）等，总相对丰度将近90%。这与臭鸡蛋的制作工艺有关，在高盐浓度发酵的环境中会存在嗜盐耐盐微生物。本研究所取样品时期为臭鸡蛋发酵末期，Halanaerobium为优势菌属，相对丰度达到53.89%；其余依次为Halomonas（11.55%）、Idiomarina（9.97%）、Halolactibacillus（4.7 7%）、Marinobacter（4.5 0%）、Clostridiisalibacter（3.53%）、Clostridium_sensu_stricto_18（2.33%）、肠球菌属（Enterococcus，1.44%）、Kosakonia（1.14%）。

1.3 臭鸡蛋卤汁样品中不同水平真菌群落组成分析

臭鸡蛋卤汁样品共鉴定出6 个真菌门，分别为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、壶 菌 门（ Chytridiomycota ） 、 球囊菌门（Glomeromycota）、毛霉亚门（Mucoromycota）、油壶菌门（Olpidiomycota）。

由图3A可知，划分至已知分类单元的真菌的优势菌门分别为Ascomycota（35.04%）、Olpidiomycota（10.10%）、Basidiomycota（9.68%）；优势菌纲分别为粪壳菌纲（Sordariomycetes，24.21%）、油壶菌纲（Olpidiomycetes，10.10%）、伞菌纲（Agaricomycetes，7.3 2%）、座囊菌纲（Dothideomycetes，5.65%）；优势菌目分别为肉座菌目（Hypocreales，19.54%）、油壶菌目（Olpidiales，10.10%）、牛肝菌目（Boletales，5.8 7%）、Dothideomycetes_ord_Incertae_sedis（2.33%）；优势菌科分别为虫草菌科（Cordycipitaceae，18.95%）、油壶菌科（Olpidiaceae，10.10%）、乳牛肝菌科（Suillaceae，5.84%）、沙漠壳菌科（Eremomycetaceae，2.33%）。

臭鸡蛋卤汁样品中鉴定出的真菌属主要有20 个（图3 B），而相对丰度大于1%的属有蜡蚧菌属（Lecanicillium，11.64%）、油壶菌属（Olpidium，10.10%）、拟青霉属（Simplicillium，7.10%）、乳牛肝菌属（Suillus，5.84%）、Arthrographis（2.33%）、Acidomyces（1.58%）、裂壳菌属（Schizothecium，1.20%）、Anteaglonium（1.07%）、Derxomyces（1.04%）。对比酸鱼、红腐乳、东北大酱和发酵乳制品（酸牛奶、酸马奶和酸驼奶）等我国传统发酵食品的真菌菌属，Lecanicillium和Olpidium是臭鸡蛋样品中独有的菌属，其中Lecanicillium是从轮枝孢属（Verticillium）真菌中分离出来的一类真菌，寄生在农业害虫和植物病原真菌中；Olpidium菌体寄生于藻类和植物细胞内，属于植物致病菌。目前，未见Lecanicillium和Olpidium参与食品发酵的报道，在臭鸡蛋样品中含有Lecanicillium和Olpidium，可能是发酵后期遭到了污染。

2 水解氨基酸含量分析

结果显示，鲜鸡蛋样品中水解氨基酸总量为（11.10±0.331）%，必需氨基酸为（4.69±0.169）%，非必需氨基酸为（6.41±0.162）%；臭鸡蛋样品中水解氨基酸总量为（6.89±0.440）%，必需氨基酸为（3.14±0.203）%，非必需氨基酸为（3.75±0.237）%。与鲜鸡蛋样品相比，臭鸡蛋样品的水解氨基酸总量减少了37.93%。

臭鸡蛋样品水解氨基酸的必需氨基酸含量占其总氨基酸质量分数的45.57%，高于世界卫生组织/联合国粮农组织（WHO/FAO）理想蛋白质标准所规定的40%。水解氨基酸中的非必需氨基酸含量占其总氨基酸质量分数的54.43%，其中必需氨基酸/非必需氨基酸为83.73%，远高于WHO/FAO理想蛋白质标准所规定的60%。这说明臭鸡蛋中的营养物质虽然有所损失，但臭鸡蛋的氨基酸组成与WHO/FAO理想蛋白质标准十分接近，能够为人体提供较为丰富的必需氨基酸。

3 游离氨基酸含量分析

游离氨基酸是重要的呈味物质，臭鸡蛋样品中游离氨基酸总量为（3.42±0.111）%，为鲜鸡蛋样品（（0.30±0.039）%）的11.4 倍。其中丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸呈甜味，谷氨酸和天冬氨酸呈鲜味，精氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸呈苦味。臭鸡蛋中呈甜味、鲜味和苦味的游离氨基酸分别是鲜鸡蛋的8.4、12.5 倍和15.2 倍，臭鸡蛋鲜味氨基酸、甜味氨基酸和苦味氨基酸分别占总游离氨基酸的21.93%、12.28%、48.83%。

4 生物胺含量分析

目前我国还没有完善的监管标准或规定限制食品中8 种生物胺含量以及总生物胺含量。唯一涉及生物胺的标准只是针对水产品，即GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》，标准中规定高组胺鱼类中组胺含量不可超过400 mg/kg，其他海水鱼类中组胺含量不可超过200 mg/kg。由图4可知，在臭鸡蛋样品中共检测出3 种生物胺，分别为色胺（69.02±0.74）mg/kg、组胺（8.33±0.53）mg/kg和酪胺（129.45±1.12）mg/kg，总生物胺含量为（206.80±2.39）mg/kg。结果表明，臭鸡蛋中的生物胺含量相对较低。

5 T-CHO、TG、HDL-C及LDL-C含量分析

人体血液中T-CHO、TG和LDL-C含量超过正常标准会增高动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发病率。而HDL-C可以降低动脉粥样硬化、冠心病等心血管疾病的发病率。由图5可知，臭鸡蛋样品中T-CHO、TG和LDL-C含量相比于鲜鸡蛋减少44%、47%和30%；臭鸡蛋样品中的HDL-C含量相比于鲜鸡蛋增加59%。

结 论

本研究利用高通量测序技术分析臭鸡蛋发酵后期的卤汁中的微生物多样性，研究发现细菌共有7 个细菌门、10 个纲、21 个目、37 个科、68 个属；真菌共有6 个门、14 个纲、14 个目、36 个科、41 个属。盐厌氧菌是卤汁细菌中最占优势的菌群。在属水平嗜盐耐盐的细菌总相对丰度将近90%，Halanaerobium占53.89%。而真菌有41.9%的OTU经UNITE数据库进行分类学注释，未能归属到任何已知分类单元，属水平的优势菌群为Lecanicillium和Olpidium，推测是发酵后期遭到了污染。通过探讨臭鸡蛋卤汁中的细菌与真菌群落组成，了解了其优势菌群的分布情况及对臭鸡蛋的风味、安全和营养等品质的影响。

臭鸡蛋中的蛋白含量虽然有所损失，但仍能为人体提供较为丰富的必需氨基酸。臭鸡蛋游离氨基酸为鲜鸡蛋的11.4 倍，丰富的游离氨基酸参与构成了臭鸡蛋的特殊风味。臭鸡蛋样品中仅含色胺、组胺和酪胺，总生物胺为（206.80±2.39）mg/kg，含量在一个安全可接受的范围中。臭鸡蛋样品中T-CHO、TG、LDL-C和HDL-C含量变化符合现今人们营养需求，对消费者的健康有利。

本文《腌制臭鸡蛋中微生物多样性分析及关键物质含量测定》来源于《食品科学》2020年41卷22期158-165页，作者：陈伟，李杨，谷新晰，谈苏慧，卢海强。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190927-329。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅