余强副教授：分化Caco-2细胞单层模型在食物-肠道相互作用研究中的应用现状及未来趋势

导 语

由于肠道具有多种多样的生理功能，食品与肠道的相互作用研究一直是食品科学与营养学研究的热点。与筛选能力有限、价格昂贵的动物模型相比，肠道细胞模型简单、可靠、可重复性强，被广泛应用于食物-肠道相互作用的研究。体外模拟肠道的功能细胞模型有很多，其中Caco-2细胞模型是应用最广泛的经典模型之一。近年来，由于各种技术的发展，Caco-2细胞单层模型得到了很大的发展，不仅克服了传统模型的局限性，而且进一步拓宽了其应用范围。南昌大学余强课题组针对已分化Caco-2细胞单层模型，综述了该模型作为体外特异性肠上皮细胞模型的应用现状和解决现有局限性的新方法，以指导其在食物因子与肠道相互作用方面研究的未来发展趋势。

1、分化Caco-2细胞模型的特征和建立方法

经过21 天的体外培养，Caco-2细胞可以在微孔膜上分化成致密的极性单分子层。大量研究证明，极化Caco-2细胞可表达肠黏膜上皮细胞的一些结构和功能特征，如微绒毛、紧密连接、绒毛膜表面特异性水解酶以及胰岛素、肽、维生素D、果糖和葡萄糖的特异性转运体。此外，存在于肠上皮细胞的刷状边缘的氨肽酶N、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶等代谢酶系也在分化Caco-2细胞中表达。因此，极化的Caco-2单层可以恰当的模拟体内肠道生化屏障。

用于建立Caco-2细胞模型的Caco-2细胞通常处于20-60代之间。在大多数实验中，Caco-2细胞的培养密度小于2.5×10 5 cells/cm 2 ，因为过高的培养密度容易导致大量细胞死亡。Transwell（如图一）是目前用于建立分化Caco-2细胞模型的专用培养工具，其根据膜材料、膜面积和孔径大小分为不同类型，可根据实验需要进行选择。随着Caco-2细胞的生长和分化，单层细胞的TEER值以及细胞内标记酶的表达和活性逐渐增加，而单层细胞对标记物的通透性降低。这些信号表明Caco-2细胞已经分化完成，该模型可以用于实验。在标准条件下，Caco-2细胞模型通常在培养15-21天后用于研究。

2、分化Caco-2细胞模型在食物-肠道相互作用研究中的应用现状

2.1肠道吸收

小肠内营养物质进入血液循环的吸收主要由肠上皮细胞完成。在分化的Caco-2细胞模型中，生长在微孔膜上的单层细胞在对应肠腔的AP室与对应肠血管和淋巴循环的BL室之间形成屏障。因此，评估目标化合物在已分化的Caco-2单层上的吸收是预测其在人体内生物利用度的体外策略之一。近年来，利用分化Caco-2细胞模型进行了大量的生物利用度研究，主要集中在以下几个方面：1)预测被动扩散营养物的生物利用度；2)评价营养物前体的吸收；3)营养物相互作用对生物利用度的影响；4)营养物结构与生物利用度的关系；5)胃肠消化对营养物生物利用度的影响。

2.2肠道转运

小肠内营养物质的膜转运可通过以下四种方式中的一种或多种方式进行：细胞外被动扩散转运、细胞旁转运、载体介导转运和胞吞作用。利用分化Caco-2细胞模型研究食物成分膜转运机制，发现脂溶性好、油水分布系数大的物质容易分布在上皮细胞脂膜内，主要通过被动扩散进入体内；对于吸收缓慢的食物因子，如亲水性营养素、肽等，主要通过细胞旁转运进入循环系统。通过比较不同载体系统在Caco-2细胞和小肠中的半最大转运浓度发现，两种载体系统中的转运蛋白可能是相同的。

2.3肠道代谢

肠上皮代谢是由I期和II期代谢酶引起的。作为I期代谢酶的主要成员，CYP将亲脂性外源底物转化为更多极性产物，并在细胞因子，脂肪酸和内源激素的氧化代谢中发挥作用。在通过外排转运体从细胞中排出之前，I期代谢物通常与II期酶结合。实际上，由于不能高表达CYP3A4，分化Caco-2细胞模型在营养物质肠道代谢研究中的应用相对较少，高表达CYP3A4的Caco-2细胞亚种TC-7在依赖CYP3A4的代谢研究中更具优势。

2.4肠道屏障

近年来，利用分化Caco-2细胞模型对肠道屏障功能的研究主要集中在食物中各种外源化合物对肠道紧密连接（TJs）的作用及相关分子机制。有研究表明即使在没有明显细胞毒性的剂量下，外源性毒素，特别是黄曲霉毒素等真菌生物毒素，也容易对分化的Caco-2单层细胞TJs造成损伤，增加单层细胞的通透性，削弱肠道屏障功能。同时肠道紧密连接损伤与多种疾病的发生有关，如炎症性肠病、肠易激综合征和腹腔疾病。分化的Caco-2细胞模型被广泛用于筛选具有肠屏障修复功能的食物因子，用于临床或辅助治疗。

2.5肠道免疫

肠上皮细胞（IEC）被认为是肠黏膜固有免疫的重要细胞成分。同时，IEC通过将抗原递送至树突状细胞和其他位于肠上皮底部的免疫细胞，在适应性免疫中也发挥着关键作用。Caco-2/免疫细胞共培养模型（图二）可以在体内模拟微环境，在一定程度上弥补了单层细胞对生理环境的模拟不足。基于Caco-2/免疫细胞共培养的肠道免疫模型已成功应用于体外筛选具有免疫调节活性的功能性因子。

2.6肠道粘附

粘附是微生物在宿主肠上皮中定植的第一步。作为成熟的肠上皮细胞模型，分化的Caco-2细胞模型已用于研究各种潜在益生菌的粘附性，从而实现体外益生菌菌株的筛选。通过将消化模型与分化的Caco-2单层细胞相结合，可以估算外源益生菌的定殖能力。除了评估益生菌的粘附能力外，分化的Caco-2细胞模型还有助于快速筛选可预防或治疗由肠道病原体引起的肠道疾病的食物因子，尤其是作为替代肠道疾病的抗生素的益生菌，改善抗生素过度使用的情况。

3、分化Caco-2细胞模型在食物-肠道相互作用研究中的未来趋势

3.1 自动化和缩短细胞培养程序，适应高通量平台

由于不同实验室Caco-2细胞的培养条件和细胞来源差异较大，所获得的单层通透性数据必然不同，TEER值的差异会导致对食物因子被动转运和功能活性的错误估计。规范Caco-2细胞的培养过程将有助于解决这一问题。通过最小化或消除人为干预的差异，以及精确调节细胞生长所必需的许多因素，自动培养细胞可以获得标准化、一致的Caco-2细胞模型。

3.2 改变培养基渗透系统的组成，校正生物利用度

通过分化Caco-2细胞模型预测营养物质的生物利用度时，结果容易受到许多因素影响，如受试物的理化性质，单层的面积，pH梯度以及与培养设备的特异性结合，这可能会导致体内体外结果不一致。通过在上室或下室添加油酸、牛黄胆酸、DMSO、丙二醇和乙腈等有机物，可改善不同原因导致的Caco-2细胞模型生物利用度预测的不准确性。

3.3 利用分子生物学研究肠道转运体或代谢酶

研究表明，部分转运体、代谢酶和核受体在单层Caco-2细胞中的表达与小肠中的表达并不完全一致，一些外排转运蛋白在Caco-2单层中表达不足，Caco-2单层不能高表达CYP3A4。TC-7作为Caco-2细胞的一个亚种，可以表达高水平的CYP3A4酶，因此在依赖CYP3A4的代谢研究中相对于Caco-2具有优势。此外，还可以运用基因修饰、基因敲除、转染、亚克隆等技术对Caco-2细胞模型进行修改，以满足不同实验的需要。

3.4 利用多细胞共培养，更好的模拟肠道细胞的微环境

Caco-2细胞单层不能形成类似小肠上皮的黏液层，而将Caco-2细胞与分泌黏液的细胞系HT29-MTX共培养可以使细胞单层形成黏液层。一维Caco-2细胞模型无法准确模拟肠道环境，无法详细研究肠道细胞间的“对话”。因此，研究肠上皮细胞与其他细胞相互作用的Caco-2细胞的二维(2D)甚至三维(3D)细胞模型开始出现。

结 语

近年来，大量研究表明，分化Caco-2细胞模型在食物-肠道相互作用研究中发挥了不可或缺的作用。分化Caco-2细胞模型作为一种具有高灵活性、高重复性、低成本的成熟体外肠道模型，已应用于肠道吸收、肠道运输、肠道代谢、肠道屏障、肠道免疫、肠道粘附等多种肠道研究。由于分化Caco-2细胞模型不能完全模拟真实的肠道环境，人们通过自动化、生物化学、分子生物学和细胞共培养等方法对其进行了大量的改进。在未来的研究中，分化Caco-2细胞模型应在不牺牲简单和可靠性的前提下，更接近内部环境，更适合于大范围的低成本的食物-肠道相互作用分析。

通信作者简介

余 强 副教授

余强，博士，副教授，南昌大学国际食品创新研究院副院长，食品学院食品科学与工程系支部书记，江西省青年井冈学者，江西省优秀博士学位论文获得者，江西省食品科学技术学会理事，江西省营养学会理事，江西省科技特派员，南昌大学青年岗位能手。曾在加拿大农业与农业食品部博士联合培养两年，科技部农村中心借调工作一年。

长期从事多糖和膳食纤维领域的研究工作，研究方向包括食源性多糖功能活性及作用机制，农产品加工副产物中膳食纤维的改性制备及综合利用，膳食纤维与小分子的相互作用等。目前主持国家自然科学基金项目3项（含面上、青年、地区各1项）、江西省重点研发计划项目1项、企业横向课题3项；已完成国家重点实验室青年基金项目1项、江西省青年科学基金项目1项（评定结果优秀）。作为骨干完成“十二五”科技支撑计划项目、863项目、国家自然科学基金重点项目等国家级科研项目10余项。近3年以第一作者或通讯作者发表SCI收录论文20余篇，申请发明专利6项，授权发明专利1项。获江西省教学成果奖一等奖等奖励。

第一作者简介

丁晓萌 研究生

丁晓萌，南昌大学营养与食品卫生学专业2018级研究生，以第一作者在权威期刊《Trends in Food Science & Technology》《Journal of Functional Foods》和《食品科学》发表论文3篇。

该文章《Differentiated Caco-2 cell models in food-intestine interaction study: current applications and future trends》在线发表于Trends in Food Science & Technology。

编辑：袁月；责编：张睿梅

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