超声辅助植物乳杆菌发酵苹果汁及草莓汁过程中菌体生长及酚类等物质代谢

富含益生菌的非乳制品开发具有广阔的前景。苹果是世界上消费最多的水果之一，富含糖类、有机酸、多酚、维生素等营养成分。食用苹果可以抑制心血管疾病、糖尿病等慢性疾病。草莓浆果富含酚类物质，常温下贮藏保鲜时间短，极易腐烂，浪费严重。苹果、草莓等常见水果及其加工产品是人类饮食中酚类物质的主要来源之一。利用乳酸菌发酵果汁既可以产生乳酸发酵的风味，又不失果蔬原料的自然风味，从而构成了发酵果汁的独特风味。

植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）在果蔬发酵领域应用广泛，如果蔬汁的发酵和泡菜的制备、葡萄酒的苹果酸-乳酸发酵等。植物乳杆菌能够产生多种酶，一方面水解释放酚类物质，另一方面转化酚类物质产生高附加值的生物活性物质。

近年来，许多研究表明低频超声波（20～50 kHz）可以促进发酵中细胞增长，缩短发酵时间；提高酶活性，促进微生物的代谢和相关生物转化。然而，目前关于超声波辅助植物乳杆菌发酵果蔬汁的研究鲜有报道。南京农业大学食品科技学院的王红梅、蒋思睿和韩永斌*等人选择富含酚类物质的苹果汁和草莓汁作为发酵基质，选取不同强度超声波辅助植物乳杆菌发酵，旨在探明超声波对植物乳杆菌发酵苹果汁和草莓汁过程中菌体生长、基本营养代谢以及酚类物质变化的影响，以期为超声辅助植物乳杆菌发酵果蔬汁的应用提供理论依据，进而为超声波对植物乳杆菌发酵果蔬过程中酚类物质变化影响的机理研究提供一定的理论支持。

1 超声对发酵过程中菌落生长的影响

植物乳杆菌在苹果汁中发酵至24 h，基本进入稳定期，菌落数达到8.59（lg（CFU/mL））（图1A）；在草莓汁中发酵至8 h即进入稳定期，菌落数为8.21（lg（CFU/mL））（图1B）。草莓汁中植物乳杆菌较早进入稳定期，且稳定期菌落数低于苹果汁中菌落数。由图1A可知，58.3 W/L超声处理提高了苹果汁中乳杆菌的生长速率。

从趋势上看，在发酵过程中，58.3 W/L超声处理的苹果汁中乳杆菌数量一直高于未超声组，特别是在32 h，58.3 W/L超声处理的苹果汁中植物乳杆菌数量为8.8 0（l g（C F U/m L）），比未超声组高1.73%（P＜0.05），而93.6 W/L超声处理对苹果汁中乳杆菌的生长无明显影响（P＞0.05），表明适当强度的超声处理可以提高乳杆菌生长速率。在草莓汁发酵中，超声处理延长了草莓汁中微生物生长的对数期。58.3 W/L和93.6 W/L超声处理的菌落数在32 h后显著高于未超声组（P＜0.05），40 h后分别高于未超声组4.73%和2.55%，其研究发现超声处理（60%振幅，超声15 s，10 g/L的蛋白胨）能够延长对数期，提高菌体增长速率，对菌体细胞的生长繁殖有促进作用。

2 超声对发酵过程中糖和有机酸类代谢的影响

PCA可将包含多个变量的数据进行降维处理，将主要信息保留在几个不相关的主成分中，苹果汁发酵样本经PCA后得到得分图和载荷图如图2所示。由图2A可见，发酵后苹果汁样本PC1值由正值变为负值，而在图2B中，果糖、山梨醇、葡萄糖在PC1上的载荷值较高，且为正值，表明苹果汁经发酵后果糖、山梨醇和葡萄糖含量下降。以未超声样品为例，发酵前苹果汁中果糖、山梨醇和葡萄糖质量浓度分别为（32.76±0.03）、（3.85±0.01）g/L和（16.33±0.07）g/L，发酵至40 h，果糖、山梨醇和葡萄糖质量浓度分别为（31.92±0.13）、（3.4 3±0.0 7）g/L和（1 4.1 0±0.3 9）g/L，葡萄糖下降最多。植物乳杆菌发酵苹果汁过程中糖和有机酸含量变化结果显示，发酵至24 h，93.6 W/L超声组的葡萄糖含量显著低于未超声组，说明超声可能促进了植物乳杆菌对葡萄糖的利用。

发酵前苹果汁中最主要的有机酸是苹果酸，质量浓度为（1 659.71±82.67）mg/L，其次为柠檬酸，质量浓度为（159.18±26.43）mg/L。结合图2A、B可知，在发酵过程中，苹果汁样品的PC1值逐渐减小，而苹果酸在PC1上载荷较大，且为正值，表明含量持续下降，反之，乳酸在载荷图中PC1为负值，因此含量增加。另外，柠檬酸和丙酮酸在PC2上的载荷较大，且为正值，在发酵过程中，苹果汁样品的PC2值先增大后减小，表明柠檬酸和丙酮酸含量先增加后减小。至发酵结束时苹果酸质量浓度减少至（303.89±38.40）mg/L，发酵苹果汁中的乳酸不仅来源于糖的代谢，也来源于苹果酸代谢。

结果显示，发酵24 h后，两个不同强度超声处理下，丙酮酸含量均显著高于未超声组，结合前述超声可能促进了葡萄糖的利用，因此进一步推测超声可能促进了糖酵解。发酵8 h，柠檬酸含量在整个发酵过程中最高，58.3 W/L和93.6 W/L超声组的柠檬酸质量浓度分别为（1 438.76±28.57）mg/L和（2 020.84±147.52）mg/L，比未超声组高155.87%和259.39%（P＜0.05）。

PCA见图2C、D。发酵24 h与发酵40 h的样品在图2C中很靠近，说明两个时间样品糖和有机酸组分接近，因此，植物乳杆菌发酵对草莓汁中糖和有机酸含量的影响主要是在前24 h。草莓汁发酵结束时，与未发酵草莓汁相比，主要表现在PC1值增大，而在载荷图2D中显示柠檬酸、苹果酸、蔗糖PC1值为负值，表明这3 种成分含量下降，而乳酸、丙酮酸、葡萄糖、果糖PC1值为正值，其对应含量增加。发酵至40 h，93.6 W/L超声处理的蔗糖质量浓度（9.15±0.06）g/L显著低于未超声处理（9.28±0.07）g/L，而且9 3.6 W/L超声处理草莓汁的果糖质量浓度（12.76±0.04）g/L也显著高于未超声组（12.25±0.27）g/L，说明超声促进了蔗糖的分解。

3 超声对发酵过程中酚类物质代谢的影响

3.1 对总酚含量的影响

由图3A可知，苹果汁发酵前的总酚质量浓度为（1 531.33±2.36）mg/L，未超声处理组发酵8 h后，总酚含量增加了0.87%，发酵8～40 h期间，总酚含量下降，发酵结束后，总酚质量浓度为（1 519.67±2.36）mg/L。由图3B可知，草莓汁的总酚含量持续升高。在0～8 h，未超声处理组总酚质量浓度由（1 314.67±2.36）mg/L增加至（1 374.67±21.21）mg/L，在8～40 h，总酚含量仍有小幅增加，但是增速大大减缓。

苹果汁与草莓汁中总酚含量的变化趋势不同，说明发酵对酚类化合物的影响与发酵原料有关，这可能是不同果汁体系中酚类物质存在形式不同所致。在现有乳酸发酵果蔬研究中，总酚含量的变化趋势也不尽相同。在苹果汁发酵至24 h和40 h时，58.3 W/L超声处理组总酚含量显著低于未超声组。在草莓汁发酵过程中，两个不同强度的超声处理下总酚含量的变化与未超声组无明显差异，这说明在不同发酵体系中超声对酚类物质代谢的影响也是不同的。

3.2 对单体酚代谢的影响

经过PCA得到图4A、B。图4A中，苹果汁发酵样本的PC1值随发酵时间延长而逐渐减小，其中，未发酵的样品和发酵8 h后的样品分布于PC1的正区间，发酵24 h和40 h的样品分布于PC1的负区间。而在载荷图（图4B）中对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸和阿魏酸对应的PC1值为正值，说明这几种酚类物质含量在发酵后均降低。以未超声样品为例，发酵前对香豆酸、绿原酸、咖啡酸、原儿茶酸和阿魏酸质量浓度分别为（1.73±0.02）、（80.27±0.45）、（1.25±0.04）、（43.08±0.05）mg/L和（3.56±0.02）mg/L，发酵结束后分别降低了6.94%、7.69%、48%、4.25%和5.62%。与之相反，没食子酸、根皮酸在载荷图中对应的PC1值为负值，经发酵后含量增加。以未超声样品为例，发酵前没食子酸和根皮酸质量浓度分别为（18.38±0.12）mg/L和（0.59±0.00）mg/L，发酵结束后分别增加了5.33%和33.90%。咖啡酸含量在发酵过程中先增加后减小，在8 h含量最高，为（2.13±0.00）mg/L。

由图4A也可以看出，在不同的时间段，未超声组与超声组在酚类组分方面存在一定差异。在发酵8 h，58.3 W/L超声组和93.6 W/L超声组在PC2的分值均高于未超声样品，而在图4B中对香豆酸和没食子酸在PC2上的载荷较大，且为正值，其酚类差异主要存在于对香豆酸和没食子酸，结合上述结论可知，超声组对香豆酸显著高于未超声处理，没食子酸含量也高于未超声处理，但差异不显著。另外，结果显示，58.3 W/L和93.6 W/L的咖啡酸质量浓度分别为（3.42±0.15）、（4.25±0.18）mg/L，分别比未超声组高60.56%和99.53%。之后，超声组与未超声组的差异主要表现在PC1，发酵至24 h，93.6 W/L超声组咖啡酸和对香豆酸仍然显著高于未超声处理组，而阿魏酸与之相反，93.6 W/L超声组根皮酸质量浓度为（0.76±0.02）mg/L，比未超声组高13.43%（P＜0.05）。在发酵40 h内，超声处理的绿原酸和原儿茶酸含量始终显著低于未超声组。而且在40 h，93.6 W/L超声处理的绿原酸含量比未超声组低10.44%（P＜0.05）。

由图4C可以看出，发酵过程中的草莓汁样本主要分布在3 个不同的区域。发酵8 h后的草莓汁样本与未发酵样品比较，PC1值减小，而在图4D中绿原酸、咖啡酸和对香豆酸在PC1上的载荷较大，且为正值，所以绿原酸、咖啡酸和对香豆酸含量减少，相反对羟基苯甲酸和没食子酸含量增加。发酵24 h样品和发酵8 h样品相比，样品PC2值增大，而绿原酸、对香豆酸、对羟基苯甲酸和没食子酸的PC2在图4D中为负值，说明含量降低，而咖啡酸PC2为正值，含量升高。发酵40 h与发酵24 h样品在得分图中很靠近，说明2 个时间样品酚类组分相似。儿茶素在图4D中靠近原点，说明此变量对PC1和PC2影响较小，结果显示，儿茶素含量在发酵过程中先增加后减小。草莓汁发酵至8 h和24 h，93.6 W/L超声处理组的对香豆酸含量均显著低于未超声组。

结合苹果汁和草莓汁中酚类物质的变化看，超声在发酵前期可提高分解咖啡酰酚类物质的水解酶活性，从而使绿原酸含量更低，而咖啡酸含量更高；而在发酵后期超声可提高酚酸还原酶的活性，从而促进对香豆酸、阿魏酸的转化，这一现象可在后续研究中通过测定转化途径中关键酶，以及利用转录组学和蛋白组学手段进一步研究验证。

4 超声对果汁发酵液抗氧化活性的影响

由图5A可知，93.6 W/L超声组植物乳杆菌发酵的苹果汁在发酵24 h后ABTS阳离子自由基清除能力显著提高。直至40 h，其抗氧化活性达到最高，为（52.17±1.59）mmol/L，分别比58.3 W/L超声组和未超声组高13.14%和36.21%（P＜0.05）。58.3 W/L超声组苹果汁在发酵过程中其清除ABTS阳离子自由基能力先增加后下降，在24 h抗氧化活性最高，为（51.76±2.18）mmol/L，与93.6 W/L超声处理组（（51.31±0.28）mmol/L）无显著差异，但是显著高于未超声组（（43.92±3.46）mmol/L）。

未超声组的ABTS阳离子自由基清除能力在发酵过程中无明显变化。如图5B所示，植物乳杆菌发酵草莓汁过程中，ABTS阳离子自由基清除能力在发酵过程中均为先增大后减小。58.3 W/L超声组经发酵8 h后，对ABTS阳离子自由基的清除能力显著提高，达到（73.55±1.69）mmol/L，显著高于未超声组（（58.31±5.40）mmol/L），但与93.6 W/L超声组（（69.45±2.47）mmol/L）无显著差异。93.6 W/L超声组和未超声组草莓汁清除ABTS阳离子自由基能力均在发酵24 h达到最大值，分别为（73.59±0.99）、（74.01±3.67）mmol/L。以上结果表明，超声辅助发酵的苹果汁和草莓汁的抗氧化活性均有一定的提升。

本研究中苹果汁和草莓汁对ABTS阳离子自由基的清除能力与总酚含量变化不相关。此外苹果汁中绿原酸含量和原儿茶酸含量与ABTS阳离子自由基清除能力呈显著负相关，这说明绿原酸和原儿茶酸分解转化后可生成一些对ABTS阳离子自由基清除能力更强的物质，其具体机制有待进一步研究。此外很多乳酸菌具有酶促和非酶氧化机制，本身也具有一定的抗氧化活性。超声处理促进了发酵苹果汁和草莓汁ABTS阳离子自由基清除能力的提高。

由图5C、D可知，苹果汁和草莓汁经植物乳杆菌发酵后，其Fe3+还原力无明显变化（P＞0.05）。测定ABTS阳离子自由基清除能力是通过在特定条件下，样品对检测体系中自由基的清除能力以反映被测物的抗氧化活性；Fe3+还原力测定法是在特定条件下，测定样品的还原能力以反映被测物的抗氧化活性。两种方法基于不同的机制，可能会得到不同的结果。

结 论

本研究发现在不同的水果汁基质中，植物乳杆菌的生长代谢有所不同。相比于草莓汁，植物乳杆菌更适宜于在经过调整的苹果汁中生长。超声处理在苹果汁和草莓汁的发酵过程中对植物乳杆菌的生长有一定的促进作用。发酵至32 h，58.3 W/L超声处理的苹果汁中植物乳杆菌数量比未超声组高0.15（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。在草莓汁发酵过程中，58.3 W/L和93.6 W/L超声处理延长了植物乳杆菌的对数期，且40 h后菌落数分别比未超声组高0.39、0.21（lg（CFU/mL））（P＜0.05）。超声促进了植物乳杆菌对葡萄糖的利用，苹果汁发酵24 h，93.6 W/L超声组葡萄糖含量显著低于未超声组，因此作为糖酵解的产物，超声组丙酮酸含量也显著高于未超声组。超声促进蔗糖的分解，草莓汁发酵24 h后，93.6 W/L超声组蔗糖含量显著低于未超声组，发酵40 h后，超声组果糖含量更高。此外，苹果汁中柠檬酸含量先增加后减小，58.3 W/L和93.6 W/L超声处理的柠檬酸含量在发酵8 h分别比未超声组高155.87%和259.39%（P＜0.05），超声对柠檬酸代谢的影响机制有待进一步研究。

在苹果汁发酵中，超声影响了多种酚类物质的变化，主要促进了苹果汁中绿原酸水解转化为咖啡酸。超声组的绿原酸含量一直低于未超声组（P＜0.05），40 h后58.3 W/L和93.6 W/L超声处理组分别比未超声组低5.82%和10.44%，而且发酵后8～24 h超声组咖啡酸含量高于未超声组（P＜0.05），发酵8 h后，58.3 W/L和93.6 W/L超声处理分别比未超声组高60.56%和99.53%。与未超声相比，超声处理在苹果汁发酵后期和草莓汁发酵前期提高了ABTS阳离子自由基清除能力。

综上所述，超声波可促进植物乳杆菌的增长、苹果汁中绿原酸的水解、糖的分解利用以及苹果汁发酵前期柠檬酸的合成，而且提高了两种发酵果汁的ABTS阳离子自由基清除能力。该结果可为超声辅助植物乳杆菌发酵果蔬汁的应用提供理论依据。除超声强度外，其他超声条件对乳酸发酵中菌体生长、基本代谢、酚类物质转化的影响需要进一步研究，以便更好地将超声应用到发酵果蔬汁的生产中。

本文《超声辅助植物乳杆菌发酵苹果汁及草莓汁过程中菌体生长及酚类等物质代谢》来源于《食品科学》2020年41卷14期72-81页，作者：王红梅，蒋思睿，陶阳，韩永斌。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20190701-017。点击下 阅读原文 即可查看文章相关信息。

为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在成功召开“2019年动物源食品科学与人类健康国际研讨会（宁波）”的基础上，将与青海大学农牧学院于2020年10月22-23日在西宁共同举办“2020年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。研讨会将就肉、水产、禽蛋、乳制品等动物源食品科学基础研究、现代化加工技术，贮藏、保鲜及运输，质量安全与检测技术，营养及风味成分分析，副产物综合利用，法律、法规及发展政策等方面的重大理论研究展开深入探讨，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

在此，我们诚挚的邀请您出席本次国际研讨会，共聚人脉、共享资源、共谋发展！

图片来源于百度图片及文章原文