Nature 重磅，线粒体基因编辑工具横空出世! 刘如谦继续革新碱基编辑器

线粒体是真核细胞重要的细胞器，参与能量代谢、细胞凋亡、维持细胞内钙铁离子平衡及生命活动信号转导。线粒体基因组由 37 个基因构成，编码 13 种蛋白。

数十年间，人类发现线粒体 DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突变与多种人类疾病相关。目前，线粒体疾病的治疗主要集中在对症治疗上，尚无纠正 mtDNA 突变的技术手段。

2020 年 7 月 8 日，来自美国华盛顿大学Joseph D. Mougous 研究组和哈佛大学Broad 研究所基因编辑大咖 David Liu（刘如谦）研究组在Nature发表了题为 A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing 的文章，通过细菌毒素在线粒体 DNA（mtDNA）中引入特定核苷酸，实现了线粒体基因的精确编辑。

此前，针对 mtDNA 基因编辑技术 MitoTALEN 和 mtZFN 通过产生 DNA 双链断裂降解突变线粒体 DNA，致线粒体 DNA 拷贝数下降。故新的碱基编辑器对人类线粒体疾病的研究和治疗意义重大。

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细菌毒素 DddA

Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究组把实现线粒体基因组编辑的关键锁定在一种可催化核苷酸中碱基胞嘧啶 C 转化为尿嘧啶 U 的细菌毒素，后者属于胞苷脱氨酶（DddA），靶向双链 DNA。

DddA 全长结构域

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线粒体基因组缺乏修复双链 DNA 断裂的有效机制。与传统线粒体基因编辑工具（核酸酶）不同，DddA 可在不引起线粒体双链 DNA 断裂的情况下将胞嘧啶 C 转化为尿嘧啶 U，使其成为完美的线粒体基因编辑工具内核。

胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 的搭建

胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 由线粒体靶向信号序列、TALE 蛋白、DddA 半体及尿嘧啶糖基化酶抑制剂 UGI 共同组成。

由线粒体靶向信号序列、TALE、半体 DddA 及尿嘧啶糖基化酶抑制剂 UGI 组成胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE

DdCBE 搭建及工作原理

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DddA 属于胞苷脱氨酶，全长 DddA 对人 HEK293T 细胞具有毒性作用。基于解析的 DddA 蛋白三维结构，研究人员将其拆分为 DddAtox-N 和 DddAtox-C 两个 split-DddAtox 半体。

DddA 属于胞苷脱氨酶，对人 HEK293T 细胞存在毒性

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研究人员脑洞大开将完整的 DddA 蛋白拆分为无活性的两个 split-DddAtox 半体，G1333 或 G1397 两个拆分位点可更好的复现 DddA 的活性

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split-DddAtox 半体与转录激活因子样效应蛋白（TALE 蛋白）融合，获得 TALE 蛋白与特定 DNA 序列结合能力。同时，两个 TALE 蛋白与 mtDNA 结合后，split-DddAtox 半体重新聚合拼装，恢复其碱基编辑活性。

N 端 2x-UGI 序列和 bpNLS 核定位序列

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最后，研究团队在基因编辑工具前端安装了线粒体靶向信号序列，解决了胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）穿越膜线粒体双层膜的导航问题；通过 N 端安装 2x-UGI 序列，提高了胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 约 8 倍的编辑效能（20%-27%），同时保护 DddA 转化的尿嘧啶 U 免受尿嘧啶 - DNA 糖基化酶切割。

胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 验证

为了验证搭建好的 DdCBE 有效性和通用性，研究人员选择了 5 种线粒体基因（MT-ND1, MT-ND2, MT-ND4, MT-ND5 和 MT-ATP8）进行验证。结果表明，DdCBE 在 HEK293T 细胞中展示了良好的线粒体碱基编辑效率（随间隔区的分裂类型、分裂方向不同在 4.6%~49%）。

DdCBE 对 mtDNA 编辑不降低细胞活力，不产生 mtDNA 缺失，不改变 mtDNA 拷贝数

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DdCBE 脱靶效应

基因编辑工具的脱靶效应一直是限制其临床应用的关键问题，也是决定其安全风险的核心要素。研究团队随后设计了严谨的实验验证了胞嘧啶碱基编辑器 DdCBEs 的脱靶。用来验证脱靶的基因序列与 mtDNA 目标基因序列差异仅为 1-2 个碱基。

研究人员证实 DdCBE 在如此严苛的条件下并不存在非目标基因编辑，提示 DdCBE 具有精确的碱基识别特异性（明显优于 CRISPR-Cas 系统），完美通过脱靶效应考核。

DdCBE 不存在非目标基因编辑

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在同期Nature上，英国纽卡斯尔大学的 Magomet Aushev 和 Mary Herbert 发表了评论观点，高度赞赏了 Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究组开发的线粒体基因编辑工具 DdCBE。

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特约专家点评

丁香学术与 BioWorld 公众号主编特邀西湖大学宋春青老师对此项研究进行点评。

近年来高速发展的 CIRPSR 基因编辑技术对于基因突变引起的遗传病带来了治愈的希望，镰刀状贫血等遗传疾病基于 CRISPR 进行的治疗已经进入临床探索阶段。目前开发的 CRISPR 技术主要是针对细胞核内的基因组 DNA, 我们知道除了细胞核外，还有一类遗传物质独立于细胞核，存在于线粒体中，称为线粒体 DNA (mtDNA)。由于线粒体的特殊结构，基于 CRISPR 治疗的外源导向 RNA（gRNA）很难进入线粒体中对 mtDNA 进行编辑。

David Liu 团队发现了一类新的可以将胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）细菌毒素 - DddA，并通过巧妙的实验设计，使之与转录激活子样效应子阵列蛋白（TALE）和和尿嘧啶糖基化酶抑制剂融合，开发了一类不依赖于导向 RNA（gRNA）并且能够直接催化 mtDNA 中 CG->TA 转化的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE）。此编辑器靶向特异性高、可以修复 49% 已知的线粒体有害基因突变，并且脱靶性低，给很多 mtDNA 突变引起的母系遗传 Leigh 综合征、线粒体肌病等线粒体遗传疾病的研究、治疗和治愈带来了希望。

结语

Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究组首次验证了细菌毒素 DddA 催化真核细胞 DNA 双链胞嘧啶 C 转化为尿嘧啶 U 的基因编辑潜能，并搭建了神器胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE。

Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究组的工作亮点在于脑洞大开让人叹为观止拍案叫绝的DddA 半体「解毒」策略。

此外，顶级科学家面前不存在包括 CRISPR 禁区在内技术壁垒。神器 DdCBE 无需引导 RNA（CRISPR-free）即可在 DNA 上精准定位。他强任他强，清风拂山岗。

与此前 MitoTALEN 相比，Joseph D. Mougous 和 David Liu 研究组开发的胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE不降低细胞活力，不产生 mtDNA 缺失，不改变 mtDNA 拷贝数。展示了优秀的安全性和巨大的应用前景。

图片来源：Science

对于线粒体突变导致的人类疾病，也许正如Science早先评论所说，turned back the clock，古细菌可能给我们更多惊喜。

同时，神器胞嘧啶碱基编辑器 DdCBE 也给线粒体基因病患者，带来了希望。而万物之中，希望至美。

图片来源：Cell

参考文献

1. Beverly Y. Mok, et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature, 2020, doi.org/10.1038/s41586-020-2477-4.

2. Magomet Aushev, Mary Herbert. Mitochondrial genome editing gets precise. Nature, 2020, doi.org/10.1038/d41586-020-01974-6.

3. Mitch Leslie. 'Old' genome editors might treat mitochondrial diseases. Science, 2018, 361(6409):1302.

4. Oliver M. Russell, et al. Mitochondrial Diseases: Hope for the FutureCell, 2020, doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.051.

题图来源：站酷海洛 Plus

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