蓝莓采后主要病原菌的分离鉴定及肉桂精油抑菌效果

蓝莓果实富含花青素、酚酸类等生物抗氧化活性成分，具有预防肥胖、糖尿病、心脑血管疾病、癌症等慢性病的保健作用。 由各种真菌病原体引起的采后腐烂是商业蓝莓生产中面临的一个重要问题。 对蓝莓果实采后主要致病菌的分离鉴定，是选择采后防腐保鲜方法的前提，明确蓝莓采后病害种类和防治方法，对于制定有效的防治措施尤为重要。

控制蓝莓采后腐烂常见技术有低温、气调、采前杀菌剂喷雾、采后化学药剂浸果等，然而这些技术具有一定的局限性。 植物精油作为广谱杀菌剂，因其作用高效性和长效性，已逐渐应用于食品保鲜中。 有研究表明肉桂精油对葡萄、番茄、芒果采后贮藏有明显的保鲜效果，但其在蓝莓采后病原菌控制方方的研究鲜见报道。

山东省果树研究所的王丹、张静和翟浩*等人从山东泰发本地产“晚丰”蓝莓上分离优势致病菌，采用传统形态学鉴定方法结合rDNA-ITS序列分析对病原菌进行分离鉴定，并对其致病性进行测定；进一步研究肉桂精油对蓝莓采后主要优势病原菌的抑菌效果，以期为蓝莓采后病害的预测预报和病原菌的绿色防治提供理论依据。

蓝莓采后病原菌的鉴定

1.1 病原菌形态鉴定结果

L1形态特征见图1a、2a，在PDA培养基上，菌丝白色绒状，后颜色变为浅灰色，不产色素。 小型分生孢子数量多，卵圆形或椭圆形，大小为（5.2～10.6）μm×（2.5～4.4）μm。 大型分生孢子月牙形、镰刀型，稍弯，顶部稍尖，多为3 个隔膜，大小为（11.4～40.2）μm×（2.7～5.5）μm。

L2形态特征见图1b、2b，在PDA培养基上，菌落初为灰色绒状，后颜色变为黑色，有同心圈。 菌丝透明，有分隔，分生孢子褐色，单生或2～5 个孢子形成短包子链。 分生孢子顶端微曲，大小（11.1～33.8）μm×（5.4～9.5）μm，倒棒锤形或卵圆形，有纵横分隔，纵隔1～3 个，横隔1～7 个，分隔处缢缩，具有圆锥状或圆柱状短喙，喙长4.2～9.1 μm。

L3形态特征见图1c、2c，在PDA培养基上，菌丝初为白色绒状，后颜色变为浅褐色，形成黑色菌核。 分生孢子梗数根丛生，直立或稍弯曲，具隔膜，顶端呈1～2 次分枝，分枝的末端膨大，上密生小梗，小梗上聚生大量分生孢子。 分生孢子卵圆形、椭圆形，无色至淡褐色，单孢，（8.3～11.3）μm×（6.3～10.1）μm。

1.2 病原菌的致病性

图3结果表明，经针刺接种的蓝莓果实均能发病。 3～5 d症状显现，7 d后均发病严重，与原发病状较一致，重新分离后，其培养性状与原菌株相同，而对照处理均不发病。

1.3 病原菌rDNA-ITS序列分析

利用真菌通用引物ITS1/ITS4对3 个纯化菌株rDNAITS进行PCR扩增，获得3 个扩增条带。 将测序获得的序列与NCBI上已知菌株进行BLAST比较，发现所测3 个菌株和已知菌株均有较高的相似性。

1.4 rDNA-ITS系统发育分析

将所测序列在GenBank数据库中进行同源比对，并将3 种病原菌的序列及其相似序列用MEGA 5.2软件的NJ法构建系统发育树，以明确病原菌分类地位。

结果显示，菌株L1与中国（寄主不详）的尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）（KU512835.1）、葡萄牙葡萄寄生菌木贼镰刀菌（F. equiseti）（MF072591.1）聚为一类，结合孢子的形态特征，将菌株L1鉴定为尖孢镰刀菌； 菌株L2与分离自中国猕猴桃（KX609761.1、KX609766.1、KX609763.1、KX609765.1、KX609764.1），中国无患子（KY213958.1）及印度分离自印度人参（KX494864.1）的链格孢菌（Alternaria alternata）聚为一类，结合孢子形态特征，鉴定菌株L2为链格孢菌； 菌株L3与分离自中国番茄灰霉病的富克葡萄孢盘菌（Botryotinia fuckeliana）（JX875915.1）、意大利（寄主不详）灰葡萄孢菌（B.cinerea）（KT587323.1）聚在同一枝，结合孢子形态特征，将菌株L3鉴定为灰葡萄孢菌。 其中富克葡萄孢盘菌为有性世代，灰葡萄孢菌菌为无性世代。

肉桂精油对蓝莓采后病原菌的抑菌活性

2.1 肉桂精油体外抑菌效果

结果显示，肉桂精油对尖孢镰刀菌、链格孢菌、灰葡萄孢菌的48 h MIC分别为60、30、30 μL/L。熏蒸72 h后，当肉桂精油在60μL/L和90 μL/L时，与对照组相比，对于3 种病原菌抑菌率均在98%以上。熏蒸96 h后，除尖孢镰刀菌抑菌率为80%外，对其他两种病原菌的抑制均在98%以上。

2.2 肉桂精油对3 种病原菌菌丝形态变化的影响

对3 个病原菌样品经临界点干燥后，进行扫描电镜观察，结果见图6。可以看出，未用精油处理的3 种菌丝体均生长健康正常，表面光滑饱满，粗细均匀一致。经肉桂精油（25 μL/L）处理的尖孢镰刀菌出现强烈变形，皱缩凹陷明显；经肉桂精油（25 μL/L）处理的链格孢菌表面粗糙，有凸起；经肉桂精油（25 μL/L）处理的灰葡萄孢菌菌丝皱缩，不平整，且菌丝之间出现严重黏连现象。

结论和讨论

经形态鉴定、分子生物学鉴定及人工接种实验，初步确定泰发产区“晚丰”蓝莓采后主要病原菌为尖孢镰刀菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌。 其中，尖孢镰刀菌引起的蓝莓果实采后病害为国内首次报道。

本研究通过体外熏蒸抑菌实验，明确了肉桂精油对蓝莓采后3 种主要致病菌尖孢镰刀菌、链格孢菌和灰葡萄孢菌的抑制作用，其48 h内MIC分别为60、30、30 μL/L，但实际效果有待于后续活体实验验证，且具体作用浓度需要综合蓝莓对精油的耐受力、精油的其他效应如抗氧化作用以及对采后果实品质的影响等指标进行全面考量。

本实验采用肉桂精油熏蒸的方式，进行体外抑菌实验。实际应用中应根据待测样品的特点及不同种类精油的抑菌特征，选择合理的抑菌方式，从而能够保证最优抑菌效果。由于精油成分的复杂性及成分间相互作用的多样性，目前国内外关于植物精油的作用机理还仅停留在根据实验结果做出的推测，因此，植物精油成分和结构以及抑菌机理有待于进一步阐明。

本文《蓝莓采后主要病原菌的分离鉴定及肉桂精油抑菌效果》来源于《食品科学》2019年40卷24期167-172页，作者：王丹，张静，贾晓曼，辛力，翟浩。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20180906-064。

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修改/编辑：袁月；责任编辑：张睿梅

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