Phytomedicine复方策略 | 血清药物化学+单细胞/空间转录组学：中药复方疏肝健脾调肠丸干预CRA的潜在基质响应靶点

【写在前面】：本期推荐的是由浙江中医药大学基础医学院合作近期发表于Phytomedicine(IF11.3）的一篇文章，多组学引导的疏肝健脾调肠丸抗结直肠腺瘤的入血活性成分及候选响应靶点鉴定。

【期刊简介】

【题目及作者信息】

结直肠腺瘤（CRA）被广泛认为是结直肠癌（CRC）腺瘤-癌序列中的主要癌前病变，其术后复发和长期进展风险仍是临床管理的重要挑战。目前，内镜切除后结合风险分层监测仍是CRA治疗的主要手段。然而，局部复发、异时性病变形成以及重复结肠镜监测的长期负担表明，仍需要更具针对性的药物策略来预防腺瘤复发和进展。传统中医药（TCM）在东亚地区已被广泛应用于胃肠道癌前病变的预防和管理，无论是作为独立疗法还是辅助治疗方法，在抑制病变进展和降低复发风险方面显示出潜在优势。疏肝健脾调肠丸（TCP）是一种根据CRA“脾虚湿蕴、气滞毒瘀互结”的病机概念开发的中药复方。它由十一味药材组成，包括党参、白术、茯苓、柴胡、白芍、炮附子、补骨脂、肉豆蔻、山药各以及炙甘草、干姜。临床上，TCP已用于CRA患者的术后调理和预防复发。然而，其生物活性物质基础和疾病相关分子靶点仍未得到充分定义。

今天分享的这篇文章采用了“体内药效评价→入血成分鉴定→组织蛋白质组学→网络药靶预测→多组学整合筛选→单细胞/空间定位→分子互作验证→细胞功能确证”的逻辑主线首次揭示疏肝健脾调肠丸抗结直肠腺瘤的入血活性成分及候选响应靶点鉴定。

【体内药效评价】

C57BL/6小鼠经AOM腹腔注射（10 mg/kg）后，进行4个周期的DSS饮水（2%，每周交替），诱导CRA形成。作者通过体内药效评价以验证TCP在AOM/DSS诱导的CRA小鼠模型中的治疗效果和安全性。

• A：AOM/DSS造模及TCP干预实验流程示意。

• B：结肠大体解剖图模型组结肠明显缩短，TCP治疗组结肠长度部分恢复。

• C：血清生化指标（UA、TP、ALT、AST、ALP）三组间无显著差异，TCP无明显肝、肾毒性。

• D：肝、脾、肾H&E染色未见明显病理损伤，安全性良好。

• E：结肠H&E染色：模型组呈腺瘤样改变，TCP组病理减轻、黏膜结构部分恢复。

• F：Ki67/PCNA染色：模型组增殖增强，TCP组增殖被抑制。

• G： 透射电镜：模型组肠上皮超微结构损伤，TCP组部分改善。

结果表明T C P 减 轻了 AOM/DSS 诱导的体内 CRA 进展 。

【入血成分鉴定】

青蒿素的开发体现了天然产物和中药衍生资源在现代药物发现中的价值。然而，中药配方的机理研究仍然具有挑战性，因为它们含有许多化学成分，这些化学成分可能会协同、拮抗或以时间依赖性方式相互作用。此外，在给药后，配方衍生的化合物会经历吸收、分布、代谢和结构转变，因此很难仅从原始提取物的化学特征来定义药理学相关的物质基础。近年来，高分辨率质谱，特别是超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS），极大地改善了复杂中药化学体系的表征。

鉴于中药复方的化学复杂性，本研究采用UPLC-MS/MS对TCP的化学成分谱进行表征，并为后续成分-靶点发现提供基础。

• A：TCP提取物总离子流图，标注35种代表性入血成分。

• C：血清样本采集时间示意（末次给药后10–180 min）。

• D：空白血清、含药血清、TCP溶液TIC比较：色谱轮廓存在明显差异，含药血清中检出28种原型入血成分，用于后续靶点预测。

结果表明 与空白血清相比，在含TCP血清中检测到79种差异化学成分。其中，28种被确定为主要入血成分，并用于后续的靶点预测和成分-靶点发现分析。此外，有35种血液相关成分也可在原始TCP溶液中检测到，进一步支持了其源自复方的来源。这些结果为优先确定TCP抗CRA的候选生物活性成分提供了基于体内暴露的化学基础 。

【组织蛋白质组学】

组学技术的快速发展进一步拓展了中药方剂研究的方法框架。蛋白质组学可以捕获组织水平上的药物反应性蛋白质变化，并提供受药物干预影响的生物过程的直接证据。

作者对小鼠结直肠组织进行蛋白质组学分析。

• A：火山图：模型 vs 正常对照（1200个DEPs），TCP vs 模型（412个DEPs）。

• B：维恩图：83个重叠蛋白中74个表达趋势相反，提示TCP部分逆转AOM/DSS相关蛋白改变。

• C： 层次聚类热图：TCP组蛋白表达谱趋向于正常对照组。

• D-E：GO富集分析：TCP响应蛋白主要富集于线粒体能量代谢（ATP合成、TCA循环、氧化磷酸化等）。

• F-G： 弦图与圆形富集图：进一步支持TCP响应蛋白与线粒体代谢的密切关联。

• H：PI网络及Hub蛋白：展示TCP响应蛋白间的相互作用网络及核心节点。

结果表明 TCP重塑了AOM/DSS诱导的CRA中的结直肠蛋白质组景观，特别是通过线粒体能量代谢相关通路 。

【网络药靶预测】

网络药理学提供了一种系统级方法来连接配方衍生成分、预测靶点、疾病相关基因和生物途径，从而支持解释中药配方的多成分和多靶点特性。

为确定TCP抗CRA的潜在靶点空间，基于上述鉴定的28种入血生物活性成分进行了网络药理学分析。

• A：维恩图：成分预测靶点（803个）∩ CRA相关差异表达基因（6,461个）= 300个候选靶点。

• B：PPI网络：300个候选靶点间存在高度连接的功能协同网络。

• C：GO富集：主要涉及激酶活性调控、离子跨膜转运、丝氨酸/苏氨酸激酶活性等。

• D： KEGG富集：涉及AGE-RAGE信号、细胞周期、MAPK信号、钙信号等通路。

• E：成分-靶点-通路网络：体现TCP“多成分-多靶点-多通路”作用特征

结果 表 明T CP可能通过一个广泛的成分相关靶点网络发挥作用，该网络涉及CRA进展过程中的细胞信号传导、代谢调节和微环境相关过程 。

【多组学整合筛选】

为优先确定CRA中的TCP响应靶点，将网络药理学衍生的300个候选靶点与AOM/DSS诱导的CRA小鼠模型中TCP逆转的差异表达蛋白进行交集分析。

• A：维恩图：300个成分相关靶点 ∩ 74个TCP逆转DEPs = EPHA7和LDHB（2个核心靶点）。

• B：外部数据集验证：EPHA7在CRA中一致下调；LDHB表达呈异质性（背景依赖性）。

• C：ROC分析：EPHA7单基因区分效能较好，联合免疫特征后AUC进一步提升。

• D：CIBERSORT分析：EPHA7主要与适应性免疫相关，LDHB主要与髓系细胞相关。

• E：正常 vs CRA免疫细胞比例比较：CRA中免疫微环境发生重塑。

综合生物信息学分析将EPHA7和LDHB优先确定为CRA中候选的TCP响应靶点 。

【单细胞/空间转录组/虚拟敲除】

单细胞转录组学能够探索候选靶标的细胞分布和微环境背景，而空间转录组学进一步支持对保存的组织结构内基因表达的解释。为确定CRA中候选TCP响应靶点的细胞背景，作者分析了一个包含来自正常和CRA组织的138560个细胞的单细胞转录组数据集。

• A：UMAP：138,560个细胞注释为12种主要细胞类型。

• B：FeaturePlot：EPHA7优先富集于成纤维细胞/CAF，LDHB广泛分布。

• C-D：CAF亚群UMAP与伪时间轨迹：CAF存在连续状态转换。
  

• E-F： CRA来源的CAF细胞富集于伪时间后期，提示疾病相关重塑。

• G：EPHA7在部分CAF亚群中高表达。

• H-J：GAM与相关性分析：EPHA7与FN1、COL1A1表达趋势相关，提示其与ECM转录程序关联。

• K-M：CAF亚型分析：正常组织以myCAF样为主，CRA中iCAF样扩增；EPHA7在myCAF样细胞中显著高表达。

结果表明体EPHA7优先与肌成纤维细胞CAF样基质表型相关，并可能反映CRA微环境中成纤维细胞/CAF相关的细胞外基质程序 。

为进一步表征EPHA7和LDHB在CRA中的空间分布和功能背景，使用代表性CRA组织切片进行了空间转录组分析。

• A：空间转录组切片H&E染色。。

• B：空间分区图谱：显示上皮、干细胞、杯状细胞、CAF、免疫区域分布。

• C：空间特征图：EPHA7信号稀疏且区域受限，LDHB分布更广泛。

• D： 信号通路空间活性：COLLAGEN/LAMININ信号主要分布于基质及上皮-基质交界区；通讯网络显示上皮、CAF、免疫细胞等为空间连接节点。

• E：EPHA7虚拟敲除扰动细胞连接、粘着斑、Wnt通路等（上皮相关群体）。

• F：LDHB虚拟敲除扰动ECM-受体互作、粘着斑、cAMP/PI3K-Akt信号等（CAF细胞）。

结果表明体LDHB可能以细胞背景依赖性方式与代谢调控和基质重塑相关转录程序相关联 。

空间转录组学和计算扰动分析为EPHA7和LDHB在CRA中提供了互补的上下文信息。空间转录组学描述了它们的空间分布和组织背景，而虚拟敲除分析则对潜在关联的生物通路进行了探索性预测。这两项分析均未提供TCP介导调控的直接证据或确立生物学因果关系。

【分子互作验证】

为优先选择代表性的TCP衍生生物活性成分进行分子对接，构建了一个基于层次分析法（AHP）的评价系统。基于AHP总分及考虑到在TCP衍生入血成分中的对接性能和代表性，选择了18β-Glycyrrhetinic acid和Wogonoside进行进一步的结合模式分析。

• A： 对接结合能柱状图：LDHB-18β-GA（-10.1 kcal/mol）最优，其次LDHB-Wogonoside（-9.2），最终选择18β-GA和Wogonoside进行后续分析。

• B-E：结合模式图：展示四种复合物的三维构象及关键残基（氢键和非共价相互作用）。

分子对接和分子动力学模拟支持TCP生物活性成分与EPHA7/LDHB之间的潜在相互作用。

• A： RMSD：LDHB复合物约5 ns达到平衡，EPHA7复合物分别约30–60 ns达到稳定。

• B：Rg：各复合物回转半径相对稳定。

• C：SASA：各复合物溶剂可及表面积保持平稳。

• D：氢键数：配体-蛋白间氢键数维持稳定。

• E： RMSF：大部分残基波动较小。

• F：自由能景观：四个复合物均呈现单一能量最低点，构象稳定。

这些分子对接和分子动力学结果为所选的TCP生物活性成分与EPHA7/LDHB之间的潜在兼容性提供了计算证据，值得对直接的配体-靶点相互作用进行进一步的实验验证。

• A： 18β-GA与EPHA7结合，KD = 5.27 μM。

• B：Wogonoside与EPHA7结合，KD = 4.91 μM。

• C：18β-GA与LDHB结合，KD = 10.3 μM。

• D：Wogonoside与LDHB结合，KD = 9.49 μM。

这些微摩尔级别的结合亲和力为18β-Glycyrrhetinic acid/Wogonoside与EPHA7/LDHB之间的直接相互作用提供了实验证据，进一步补充了分子对接和分子动力学模拟的结果。

【细胞功能确证】

为初步验证优先确定的TCP衍生成分，用Wogonoside和18β-Glycyrrhetinic acid处理HCT-116细胞。

• A： CCK-8：两种化合物均呈浓度依赖性抑制细胞活力。

• B：流式细胞术：两种化合物均剂量依赖性促进凋亡。

• C： Western blot：化合物处理后EPHA7和LDHB蛋白水平上调。

• D：qRT-PCR：EPHA7和LDHB mRNA水平上调，与蛋白趋势一致。

• E：高内涵免疫荧光：EPHA7和LDHB荧光信号增强

这些发现表明Wogonoside和18β-Glycyrrhetinic acid在体外能抑制HCT-116细胞活力、促进凋亡并上调EPHA7和LDHB表达，为其与TCP响应候选靶点的关联提供了初步支持。

• A-B： 体内WB/qRT-PCR：模型组EPHA7和LDHB下调，TCP处理后恢复至接近正常水平。

• C-D：siRNA筛选：si-EPHA7-1和si-LDHB-3敲低效率最高，用于后续实验。

• E-J：敲低+化合物处理：NC siRNA组化合物上调靶点表达；靶点siRNA组基础表达降低，化合物诱导的上调被部分阻断（WB及qRT-PCR验证）。

• K-L：EdU增殖检测：NC siRNA组化合物处理减少EdU阳性率；靶点敲低组化合物的额外抑制效应减弱，证明EPHA7和LDHB部分介导了化合物的抗增殖作用。

这些发现表明，EPHA7和LDHB对TCP及其代表性生物可利用成分有响应，并可能部分促成了它们的抗增殖效应。尽管如此，这些结果支持功能参与而非直接的分子靶点结合。

【结论与讨论】

综上，作者的研究提供了一个多组学引导的框架，用于鉴定TCP抗CRA的入血生物活性成分和候选响应靶点。Wogonoside和18β-Glycyrrhetinic acid被优先作为代表性的入血成分，而EPHA7和LDHB被确定为潜在的TCP响应靶点，具有不同的基质通讯和代谢相关生物学背景。SPR分析支持这些代表性成分与EPHA7/LDHB之间的直接结合，而靶点特异性敲低提供了EPHA7和LDHB部分促使其抗增殖效应的初步证据。综合证据表明，TCP可能通过调节上皮-基质-ECM-代谢网络而非通过单一靶点或通路来干扰CRA进展。这些发现促进了对TCP药理基础的理解，并为结直肠癌前病变的进一步机制和转化研究提供了理论依据。

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