bluesens基于二氧化碳驱动的pH基准方法用于发酵工艺的转移与放大

摘要

本文提出一种基于二氧化碳的替代方法，可突破传统离线pH测量方式的局限，不受各现场取样离线pH测量操作流程的影响，实现全球可比对的pH数值。在无细胞培养基体系下，当生物反应器内二氧化碳通入量与移除量相等时，体系pH保持稳定，气液两相之间二氧化碳净传质为零。此时，气相二氧化碳浓度不再受传质动力学相关参数影响，因此具备规模无关性。

引言

过去数十年，发酵工艺的放大、缩小以及工艺转移工作主要聚焦于工程层面。

但对于细胞培养工艺，仅依靠上述工程参数，尚不足以保证大小规模之间pCO₂、乳酸浓度、生长速率、补碱量，以及最终产物浓度与质量属性的可比性。而pH、溶解氧这类参数不受设备与场地限制，通常由对应的控制回路进行维持。pH对工艺表现至关重要，在工艺放大中同样意义重大。

目前生物反应器探头的监测与校正，仍依赖取样后离线pH读数。但样品pH会受多种因素影响：二氧化碳脱气、温度、悬浮细胞整体呼吸作用等，取样后样品pH会与反应器真实pH产生偏差。此外，离线测量结果还会受探头类型与老化程度、培养基性质、日常校正流程、响应时间、操作人员等因素干扰。

而这些偏差恰恰来源于离线取样pH测量本身，无法通过该手段检测与量化。依靠取样离线pH测量，很难达到所需精度，无法实现高效工艺转移所必需的跨场地pH直接比对。

为降低工艺波动与潜在质量风险，提升故障排查、工艺放大与工艺转移效率，必须开发一种能够识别常规手段无法检出的pH偏差的方法。

研究背景

行业通用的离线pH测量，需要从生物反应器取样，再使用各类设备方法测定样品pH。发酵工艺中，灭菌后的内置探头，通常依据离线测量数值完成校正。受方法本身、操作流程差异、二氧化碳脱气、温度下降、细胞持续代谢等因素影响，偏差不可避免。不同厂区之间离线pH测量偏差最高可达0.3，造成工艺转移困难，需要耗费大量时间与成本开展故障排查。

图 1：以二氧化碳气体作为酸性 pH 校正剂的 pH 控制标准装置

本文提出的新方案（图2）利用尾气CO₂数据，能够消除离线pH测量引入的各类偏差；接种前无需取样即可完成反应器内置pH探头校正。CO₂信号直接对应在线探头信号，进而与pH控制器联动。

图2：基于尾气参比法的先进pH控制方案

方法原理

为克服离线测量带来的偏差问题，可以利用气相二氧化碳与液相质子活度（由pH表征）之间的化学关联。根据亨德森‑哈塞尔巴尔赫方程：在相同培养基中，温度、压力、pH一致时，气相二氧化碳浓度必然相同。

该化学关联不受传质相关参数影响；达到平衡状态（pH、温度、压力恒定）时体系净传质为零，因此具备普适性，即与反应器规模无关。因此，生物反应器尾气中的CO₂水平可用来间接判断反应器内部pH是否处于目标区间，不必完全依赖本身存在缺陷的离线pH取样测量。

原理验证

小试实验在2 L反应器开展，采用集成BlueSens传感技术的GA4尾气分析仪（德国Eppendorf）。2 L、100 L、400 L、10000 L规模实验同时使用GA4与BlueInOne尾气分析仪（德国BlueSens）。

图3展示细胞培养基在不同工作体积（对应不同vvm）下的pH与尾气CO₂浓度，实验改变P/V、kLa、桨叶线速度，搅拌转速最高1500 rpm；对比带挡板与无挡板罐体，还分别采用单搅拌桨、双搅拌桨研究搅拌的影响（相关数据本文未展示）。

图3：不同体积细胞培养液下尾气二氧化碳浓度与pH的相关性

即便在1500 rpm这类极端搅拌条件下，尾气CO₂与pH的对应关系依然保持不变。对比顶空通气与底部浸没通气，除达到平衡的时间存在差异外，二者无其他区别。

为验证规模无关性，将实验工艺放大至更大体积。图4对比2 L玻璃反应器与100 L、400 L不锈钢反应器结果，为完成该对比，对内置pH探头重新校准，并将pH控制器偏差调至最小；实验中P/V、kLa、桨叶线速度、装液体积、vvm、搅拌器构型均未保持恒定。

图4：生物反应器尾气的pH值与对应二氧化碳浓度

结果明确证明：尾气CO₂与pH的对应关系保持不变，该关联不受反应器规模以及上述各类操作参数影响。在其他条件完全一致的前提下，乳酸浓度可以作为pH的指示信号。

采用玻璃电极离线取样法、尾气CO₂基准法得到相同pH设定点时，对内置探头重新校准后，反应器内部实际pH并不相同；取样和离线测量会引入固有偏差。 研究对比两种校准方式下乳酸的波动情况，乳酸是胞外培养基中非常理想的pH指示物：pH越高，CHO细胞会通过乳酸‑质子同向转运体分泌更多乳酸。因此在其余条件可比的前提下，对比乳酸水平，就可以识别由pH带来的工艺波动。

图5：同等实验条件下，采用取样离线测量pH（橙色曲线），乳酸水平存在差异。若采用基于尾气的pH参比方法评估pH并校正生物反应器探头，在同一pH设定值下，乳酸水平几乎完全一致（绿色与红色曲线）。

图5展示最长200 h工艺周期内，乳酸作为pH指示信号的变化；全程仅内置pH探头的校准方式不同，就能观察到显著差异。绿色柱代表基于尾气CO₂的pH基准方法，橙色柱代表传统离线pH测量。该2 L实验在彭茨贝格的非GMP项目开发平台完成。

结论

本文提出一种简单、非侵入式方法，利用尾气CO₂间接监测、控制无细胞体系的pH。借助该方法，可以在工艺转移、放大、缩小过程中，在不同工厂、场地、反应器规模之间精准匹配初始pH。

故障排查效率得到提升；后续批次可识别并建立跨批次pH可比性。该方法给出明确判定依据，可排除pH偏差作为工艺异常来源。最终降低生产批次间波动，提升工艺可比性；研发阶段波动显著下降，工艺开发效率提高。

总而言之，该方法可以规避有缺陷的离线取样pH读数带来的异常工艺风险。对于碳酸盐缓冲体系，这套基于尾气的pH基准方案，简单经济、可重复、稳定性强，能够检出传统手段无法发现，但实际存在的pH偏差。