81.2分！川大华西博士生一篇STTT玩转泛素化修饰

今天这篇文章有点意思，这篇文章是四川大学华西医院刘伦旭/李凯/林苹教授团队的博士生，发表在81.2分的STTT上的文章。这篇文章讲的是泛素化修饰通过维持蛋白稳定性，导致了下游E-Cadherin/β-Catenin轴的激活，导致了β-Catenin入核，激活了下游（其实E-Cadherin大家都应该比较熟悉了，在EMT信号通路以及细胞粘附中都经常会看到，而β-Catenin其实也是细胞粘附和Wnt信号通路中关键的转录相关因子，β-Catenin被E-Cadherin释放后，会入核激活下游转录）。那么，我们就一起来看看，他们都做了点什么吧：

他们要研究的是DDX39B这个蛋白，在NSCLC（非小细胞肺癌）中的表达情况，或者说分析一下DDX39B在NSCLC中的功能。于是首先他们通过蛋白芯片，确定了一下DDX39B的表达。结果显示DDX39B蛋白在NSCLC组织中表达水平显著升高，其表达与淋巴结转移以及TNM分期，都呈现正相关（这其实就是通过归纳法中米勒五法的求异法分析获得的，也就是通过归纳统计确定NSCLC与癌旁对照组中组织样本的DDX39B蛋白水平的表达差异，确定了DDX39B与NSCLC之间存在的相关性）。而DDX39B的表达与脑转移灶也密切相关，同时也是患者总生存率的独立危险因素：

DDX39B的蛋白表达水平，在转移中异常升高，而这样的表达仅限于蛋白水平，在mRNA水平变化不大。那么这里NSCLC的转移灶中，DDX39B的蛋白表达水平是通过什么途径增加的呢（这个假设迭代其实也是根据之前的实验结果推理得到的，在之前的结果中，他们发现了NSCLC转移灶的细胞中DDX39B的蛋白水平产生了明显的差异，同时DDX39B与预后差直接关联，而DDX39B仅在蛋白水平有差异，mRNA变化不大，于是依旧有了这样的假设迭代）？于是他们构建了EMT的肿瘤细胞模型，以及颈动脉注射脑转移细胞，构建了脑转移衍生细胞模型。结果发现在EMT模型和脑转移衍生细胞中，DDX39B的胞质分布增加、蛋白半衰期显著延长。这样的结果，其实提示了我们在转移灶中，DDX39B，可能存在翻译后的修饰调控。

那么如果说DDX39的蛋白是通过翻译后调控产生的影响，那么就可能与E3泛素连接酶相关。于是他们首先分析了能与DDX39结合的E3连接酶。通过验证，他们发现DDX39B与E3连接酶TRIM28可以直接互作结合，通过分子对接和点突变，他们发现DDX39B的P322残基，则是两者结合的关键残基（这样的点突变验证，其实是比较好的验证手段，但是有一点需要注意的，就是两者之间的结合位点，是要对后期的验证所提供技术支持的，也就是既然已经找到了两者互作的残基，那后期的验证就要基于两者的互作这个概念来进行验证，而不能单纯地进行敲减或者过表达了）：

接着他们通过敲减和过表达TRIM28，并使用CHX、蛋白酶体抑制剂MG132和溶酶体抑制剂CQ进行验证，并通过WB分析了TRIM28对DDX39B连接的泛素连接方式，他们发现TRIM28会在DDX39B的K241/K384/K398残基上，催化DDX39B的K63连接多聚泛素化，同时伴随着K48泛素连接的降低。从而增强了DDX39B蛋白的稳定性，而进一步使用P322A或者3KR突变进行验证，他们发现可以有效阻断这样的泛素化及蛋白稳定性效应（这里使用P322A其实就已经说明了这个DDX39B蛋白泛素化的过程，是完全依赖于TRIM28的，因为在这里使用的是对DDX39B上与TRIM28结合位点的残基进行的突变，也就是说这里的验证就是基于两者互作所造成的，和简单粗暴地敲除TRIM28形成了对比，这样的验证可以有效避免肯定后件的逻辑谬误）。

接着，这篇文章比较不错的地方，就是他们后期的验证都是基于DDX39B的这两个突变位点来的，也就是通过对DDX39B的野生型和P322A/3KR突变体进行比较，分析其被TRIM28进行了K63泛素化修饰后，对肿瘤细胞的迁移侵袭能力产生了什么样的影响（这里其实就是演绎法中柯霍氏法则的验证，也就是通过移入或者移除关键因素，查看下游表型所产生的变化，从而建立起两者之间潜在的因果关联性，在这里他们分析的是DDX39B与TRIM28互作的P322残基以及三个泛素化修饰的赖氨酸残基缺失对下游迁移表型的影响，缩小了验证的外延，做得还是不错的）。结果显示DDX39B野生型，会促进肿瘤细胞的迁移、侵袭、干性、F-actin重构以及EMT，同时也激活了脑内及远端器官转移转移，而P322A/3KR突变体则无此功能：

那么既然野生型DDX39B能促进肿瘤细胞转移，是否会存在一个其潜在的互作蛋白呢（这个假设迭代，其实就是基于之前的实验结果所得到的，因为之前的实验结果说明了DDX39B与肿瘤的迁移侵袭密切相关，主要也就是野生型在蛋白表达维持的前提下造成的，这也就说明了野生型的DDX39B可能会通过其蛋白互作，导致下游EMT等表型的影响，于是就有了这样的假设迭代），通过PPI分析，他们发现DDX39B能与E-Cadherin结合。通过互作实验，他们也确定了两者的确会产生互作，通过E-Cadherin的泛素化检测，及其磷酸化检测，他们发现DDX39B主要是作为蛋白支架直接结合E-Cadherin，通过招募Src，对E-Cadherin的Y754残基进行磷酸化，同时会招募E3连接酶Hakai对E-Cadherin进行泛素化修饰，促进E-Cadherin进入到溶酶体降解。

接着，他们在过表达DDX39B的肿瘤细胞中，回补表达E-Cadherin，然后分析了肿瘤细胞的体内外迁移侵袭以及远端转移能力。结果发现回复表达E-Cadherin，可以显著逆转DDX39B过表达所诱导的迁移、侵袭、干性、EMT重编程以及体内转移的能力，通过这个实验，他们试图证明E-Cadherin降解是DDX39B促转移的关键下游事件（实际上吧，这里的验证并不如之前的验证来得严谨，之前的验证精确到了DDX39B与TRIM28的互作，那样的验证是严谨的，但这里他们已经确定了DDX39B是作为E-Cadherin的支架蛋白，也就是说实际DDX39B起到作用的关键还是互作，但是他们的验证却是通过表达的相关性入手的，这里就有点不够严谨了，这里也应该通过对两者蛋白互作位点突变来进行验证），而P322A/3KR突变后的DDX39B，不但是促进了E-Cadherin的稳定性，也加强了E-Cadherin和β-Catenin的结合，导致β-Catenin无法入核激活转录：

这篇文章其实前期的验证还是不错的，但最后分析DDX39B作为支架蛋白结合了E-Cadherin这段，有点粗略了。总的来说是一篇不错的文章，给这篇文章评个分的话，差不多是这样:

今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。

（本文仅讨论文章本身，对超出文章以外的内容并不多做评价，如有异意，欢迎在评论区讨论）

给你讲讲科研中的推理和逻辑