Nat Genet | 高通量引导编辑平台揭示哺乳动物组蛋白H3关键赖氨酸功能谱

撰文|木兰之枻

组蛋白翻译后修饰是调控染色质结构和基因表达的 核心 机制。然而，要在哺乳动物系统中直接解析特定组蛋白残基的功能一直极具挑战，这主要是因为经典组蛋白基因在进化过程中发生了扩增，且分散在 不同 染色体 的基因 簇中。例如，在小鼠细胞中， 经典 组蛋白H3由9个H3.1基因和3个H3.2基因共同编码（共涉及24个等位基因）。研究 者 曾通过人工组蛋白基因簇在果蝇中对组蛋白突变进行了系统性分析【1】。 近期也有研究利用CRISPR碱基编辑技术在小鼠胚胎干细胞（ESCs）中成功构建了H3K27突变体，以开展功能探索【2】。 但碱基编辑受到编辑窗口狭窄、易产生旁观者突变以及可实现的氨基酸替换类型有限等的限制 ，限制了 其在所有组蛋白残基 研究中的广泛应用 。2019年，David Liu实验室开发的CRISPR引导编辑（prime editing，PE）可实现 单碱基的随意转换【3】（ 详见BioArt报道： ） ， 这一突破为系统性筛选和研究组蛋白关键残基提供了 关键 的技术支撑。因此，将引导编辑技术扩展并应用于多拷贝的组蛋白基因体系 有望推动 哺乳动物组蛋白残基功能 研究的进步。

近日，英国癌症研究所的 Aliaksandra Radzisheuskaya 团队在 Nature Genetics 在线发表了题为 Identifying critical lysines in mammalian histone H3 with high-throughput CRISPR prime editing 的研究论文。 文章构建了针对多拷贝组蛋白H3基因的高通量CRISPR PE编辑平台，并在此基础上对哺乳动物H3关键赖氨酸的功能开展了系统研究， 鉴定出 包括 H3K4、H3K9、H3K14、H3K18以及H3K79等对细胞 功能 至关重要的关键残基位点。

研究 者 首先 以 H3K23R突变为 验证 靶标，系统比较了PE2、PE3b、PE4和PE5b等不同 PE 体系的编辑效率。结果表明，联合使用epegRNA、切口RNA（nickRNA）以及显性负性MLH1（MLH1dn）的PE5b系统， 可 在实现高编辑效率的同时保持了 低 插入缺失（indel）频率。鉴于长期抑制错配修复可能引发基因组不稳定性，研究 者 在小鼠胚胎干细胞中构建了由多西环素（doxycycline）调控的TetO-PEmax-2A-MLH1dn-2A-BFP诱导型细胞系（TPMB）。在 点突变 单细胞克隆筛选中， 研究者发现 约35%的克隆表现出超过80%的 H3K23R 突变率，并成功分离出在所有靶向等位基因上均实现突变的H3K23R细胞系。随后，研究 者 利用 新 体系尝试构建H3K14R和H3K18R突变体，发现其编辑效率显著低于H3K23（分别低于67% 和50%），且无法获得 纯合 突变的细胞克隆。通过引K-to-K同义突变作为对照，研究 提示 H3K14R和H3K18R突变会引发细胞适应性缺陷，导致高度突变的细胞在生长竞争中被淘汰。 除有效性之外 ，研究 者 还证实了该平台的灵活性：不仅能够将H3K23R精准恢复至野生型状态，还能在跨度为28 bp的编辑窗口内，实现对H3K14、H3K18和H3K23的同步组合编辑。

借助PE 编辑 平台，研究 者 揭示了组蛋白变体之间存在的代偿机制。在经典组蛋白H3.1/H3.2 发生部分H3K18R突变的细胞中，总体 H3K18ac 仍保持在接近正常的水平；只有进一步对非经典组蛋白H3.3进行K18R突变后，才会导致H3K18ac修饰水平下降。CUT&Tag 和质谱（MS）分析表明，H3.1/H3.2K18R 突变细胞 内 非经典变体H3.3在染色质中的整体掺入比例 增加 ，H3K18ac在全基因组范围内 也 发生明显的重分布，其信号在H3.3富集的调控元件（如活性启动子和强增强子）区域出现了特异性增加。

由于H3编辑涉及多拷贝位点的同时编辑， 研究还 对潜在的组蛋白基因簇内的大范围基因组改变进行了评估。结果显示，H3点突变细胞中会出现组蛋白基因簇1 兆碱基 或千碱基范围的缺失，不同突变类型细胞内拷贝缺失频率 约为4%-34% 。研究还发现， 切口向导RNA （nickRNA）对大范围基因组改变 的影响具有位点依赖性 ，如使用nickRNA的两个 H3K23R克隆 中 出现20-35 kb缺失，而对照 组并无这类改变 。

随后， 研究者针对 经典H3的13个赖氨酸 位点开展 高通量适应性筛选： 各 位点均设计K-to-R功能突变及K-to-K同义 突变 对照。筛选结果显示，H3K4R、H3K9R、H3K14R、H3K18R 和H3K79R突变细胞受到强烈的负选择。H3K27R仅表现出轻度适应性下降，而 H3K23R、H3K36R、H3K37R、H3K56R、H3K115R和H3K122R突变在常规培养条件下均能顺利产生高度或完全编辑的克隆；其中，H3K64R 甚至表现出轻度的适应性增益。特别值得注意的是，由于等位基因的序列差异，H3K4靶向编辑需要同时使用5条epegRNA实现多重覆盖；且即便通过延长编辑时间进行优化，H3K4的K-to-R突变仍很难获得，这凸显了H3K4对于维持细胞适应性的重要性。

在功能验证方面，研究人员通过免疫印迹（Western blot）、CUT&RUN / CUT&Tag 以及质谱（MS）分析证实，多种 K-to-R的突变型组蛋白 可 成功掺入到染色质中，并导致了相应组蛋白修饰的丢失。实验还发现，H3K56R 突变细胞对基因毒性药物依托泊苷（etoposide）表现出更高的敏感性，这表明 H3K56 在维持/调节基因组稳定性方面的作用，从酵母、果蝇到哺乳动物细胞均具有进化保守性。此外，研究者通过顺序编辑（sequential editing）成功构建了多种双突变体，其中H3K27R+H3K36R和H3K27R+H3K37R的组合削弱了细胞的 克隆 形成能力，表明其损害了干细胞的自我更新功能。RNA测序结果显示H3K27R+H3K36R双突变体中基因表达的变化主要表现为上位效应，较少部分基因表现为缓冲效应或新发转录响应。其中，新发响应组中的基因显著富集于与细胞分化、增殖和转录调节相关的通路中，这与双突变体细胞干细胞自我更新能力下降的表型是一致的。最后，研究团队还测试了通过单条 epegRNA 一次性引入多个组蛋白突变配置的可行性。结果表明，利用单条 epegRNA 实现“多位点同步突变”在技术上是可行的，但其突变效率实质上要明显低于分步依次进行的顺序编辑。

综上所述， 本研究将CRISPR引导编辑成功拓展为针对多拷贝组蛋白基因的系统功能学研究平台，实现了对经典与非经典组蛋白H3基因精确、可逆、变体特异性以及组合式 编辑 。该研究不仅系统性地绘制了哺乳动物组蛋白H3赖氨酸的功能图谱，也为未来系统解析染色质调控机制提供了 新的普适性 平台。

https://doi.org/10.1038/s41588-026-02675-y

制版人： 十一

参考文献

1. Zhang, W. et al. Probing the function of metazoan histones with a systematic library of H3 and H4 mutants.Dev. Cell48, 406-419 (2019).

2. Sankar, A. et al. Histone editing elucidates the functional roles of H3K27 methylation and acetylation in mammals.Nat. Genet.54, 754-760 (2022).

3. Anzalone, A. V. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA.Nature576, 149-157 (2019).

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