Plant Cell | 南方科技大学吴柘团队揭示植物外显子连接复合体EJC的结合动态和功能

真核生物的基因表达依赖mRNA前体经历5'端加帽、3'端Poly(A)加尾和RNA剪接等一系列精细加工，形成具有功能的成熟mRNA。其中，RNA剪接不仅去除内含子并连接外显子，还会在RNA上留下影响其命运的“分子印记”，调控RNA的加工、输出、翻译和降解。外显子连接复合体（Exon Junction Complex，EJC）就是一种随剪接沉积在外显子连接处的重要RNA结合复合物。在动物中，EJC参与mRNA出核、翻译调控及无义介导的mRNA降解等多个关键过程。然而，植物与动物存在显著差异：植物中广泛发生内含子滞留（Intron Retention，IR），产生大量携带提前终止密码子（PTC）的内源异常RNA，但这些RNA是否依赖EJC介导的NMD加以清除，迄今仍缺乏直接证据。有趣的是，RNA降解组研究发现，植物EJC可广泛结合于正在降解的RNA，提示其结合动态及RNA命运调控机制可能不同于动物经典的“首轮翻译移除EJC、随后RNA降解”模式。因此，植物EJC如何解读RNA剪接信息，并将其转化为RNA命运决定的分子信号，仍然是理解植物基因表达调控规律和RNA质量控制机制的关键科学问题。

近日，南方科技大学生命科学学院吴柘副教授团队在The Plant Cell发表了题为The RNA-binding dynamics of the exon-junction complex underlying splicing-coupled RNA fate determination in Arabidopsis的研究论文，揭示了植物中RNA命运决定的关键节点分子-外显子连接复合体（EJC）-伴随RNA加工结合RNA的详细分子动态，区别于此前基于动物细胞中的结果，研究发现了植物EJC在内含子 3’端存在瞬时结合，此外，无义介导的mRNA降解（NMD）对EJC依赖性不强，而植物EJC对RNA的剪接发挥重要调控作用。

研究首先利用eCLIP-seq绘制了EJC核心组分eIF4AIII全转录组结合图谱：eIF4AIII结合峰富集在外显子连接处上游-25 ~ -30 nt，区别于动物 - 20~-24 nt 的定位特征。依据RNA剪接状态将eCLIP-seq reads分类分析后发现：上述结合特征确实由剪接完成后的RNA提供。此外，同样区别于动物中的发现，研究发现未剪接 RNA 测序信号在内含子 3'端形成明显结合峰。进一步，在剪接抑制剂Herboxidiene处理后进行eIF4AIII-eCLIP-seq, 对比处理前对照组发现外显子-外显子连接处结合峰大幅衰减，而内含子 3’端结合峰显著增强，说明植物EJC的沉积可能经过一个先从“内含子3'端”再到“外显子连接处”的动态过程（图1）。

图1：拟南芥EJC剪接偶联的结合动态

进一步，研究定义了两项量化EJC与RNA结合强弱的指标：结合强度（EJC对单位转录本的平均结合量）以及结合稳定性（EJC与RNA结合的持续时间）（图2）。分析发现RNA代谢及基础代谢相关的基因常显示出较高的EJC结合强度，而逆境响应相关基因常显示较高的EJC结合稳定性，暗示了EJC对不同RNA具有差异的结合动态以及多样的调控功能。有趣的是，不论是EJC的结合强度还是结合稳定性都展示了与基因上内含子个数间显著的正相关（排除基因长度影响）。值得一提的是，此前报道显示植物中内含子个数也与共转录RNA剪接效率及Pol II在3’端停顿时间正相关。这些发现共同凸显了植物基因内含子个数可能是RNA代谢的重要决定因素，增多的内含子可显著增加EJC的结合以及后续的RNA加工及质量控制的严谨性。

图2：EJC 结合强度与结合稳定性代表了两种衡量EJC结合强弱的指标

为解析eIF4AIII在植物中的生物学功能，研究构建了雌激素诱导的eIF4AIII敲低株系。诱导敲低eIF4AIII导致幼苗严重发育迟滞，并引起上万个内含子保留（IR）事件的变化。其中，超过70%的相关基因存在eIF4AIII直接结合，且IR变化幅度与eIF4AIII结合强度总体呈正相关，表明eIF4AIII主要通过调控内含子稳态影响RNA剪接或降解。相比同一基因中不受影响的内含子，eIF4AIII依赖性变化的内含子普遍具有更高的EJC在内含子3′端结合和更低的共转录剪接效率。此外，与UPF3（细胞质NMD核心因子）和HEN2（核内RNA降解核心因子）调控的内含子相比，eIF4AIII靶标内仅存在有限重叠。此外，不同于UPF3靶标，许多eIF4AIII依赖性内含子并不在翻译抑制条件下积累，提示其并非主要作为翻译偶联的RNA降解底物。因此，植物EJC主要通过调控内含子剪接效率，而非促进RNA降解，维持内含子稳态（图3）。

图3：拟南芥EJC通过剪接双向调控内含子保留RNA的稳态

最后，研究利用CRISPR-Cas9介导产生的突变体，进一步探究了EJC在植物NMD中的作用。在植物的研究中，CRISPR编辑常通过插入/缺失造成移码突变并产生提前终止密码子（PTC），从而获得基因功能缺失材料。与天然产生的PTC转录本（如内含子保留转录本）通常仅占同一基因座转录产物的一小部分不同，CRISPR编辑在DNA水平引入突变，使基因座上产生的所有转录本均携带PTC，为研究PTC诱导的RNA降解提供了理想模型。研究收集了41个CRISPR编辑突变体，其中27个携带PTC；在这些突变体中，22个表现出显著降低的mRNA水平，提示CRISPR引入的PTC普遍触发了RNA降解。进一步分析其中两个包含PTC的突变体，发现，相比野生型，转录抑制后其mRNA水平随时间下降更快，而翻译抑制则导致其mRNA快速积累，表明这些转录本受到翻译依赖的NMD降解。值得注意的是，即便EJC被定位于PTC下游的外显子连接点（动物中触发NMD的关键条件），敲低eIF4AIII仍未影响这两个突变体中产生的携带PTC的mRNA降解，说明至少在这两个案例中，EJC并非植物NMD降解的必需因子。同时，这些结果提示延长的3′UTR可能在植物NMD识别中发挥更重要作用（图4）。

图4：CRISPR编辑产生的含PTC转录本受NMD降解，但不依赖EJC

综上所述，该研究首次构建了模式植物拟南芥中EJC的高精度结合图谱，揭示了EJC在外显子连接点上游结合具有跨界保守性，同时发现植物EJC具有区别于动物的内含子3′端结合特征，并主要通过调控RNA剪接而非NMD参与内含子稳态维持。研究结果提示，植物NMD的调控机制可能存在不同于动物的特异性调控模式，仍有待进一步解析。本研究为未来基于RNA-蛋白互作及RNA加工过程开展植物合成生物学设计提供了理论基础。

南方科技大学生命科学学院吴柘副教授和朱丹灵研究副教授为论文共同通讯作者，南方科技大学为论文第一完成单位。南方科技大学2019级博士毕业生孙凯文、2024级博士生黄舒颖、中国水稻研究所赵凤利副研究员（原南方科技大学博士后）为论文共同第一作者。南方科技大学谭义访博士、南京大学昌永胜博士（原南方科技大学研究助理）、山东大学白明义教授参与了本项研究。北京大学瞿礼嘉教授、秦跟基教授和钟声教授为研究提供了重要实验材料支持。该研究得到了深圳市科技创新委员会、国家自然科学基金以及广东省基础与应用基础研究基金的资助。

文章链接：

https://academic.oup.com/plcell/article/38/7/koag212/8726529