Cell Rep Med丨毕秀丽团队构建可口服的CRISPR-Cas9工程化益生菌水凝胶，靶向编辑 NOX2/gp91ᵖʰᵒˣ阻断ROS过量蓄积治疗炎症性肠病

炎症性肠病（IBD）是全球高发慢性肠道炎症疾病，病灶处活性氧（ROS）水平较健康组织高出 10–100 倍，过量 ROS 会破坏肠道上皮屏障、放大促炎因子释放，长期氧化应激还会提升结直肠癌发病风险【1】。肠道免疫细胞通过 NADPH 氧化酶 2（NOX2）介导的呼吸爆发是 ROS 最主要来源，gp91phox 作为 NOX2 催化核心亚基，是驱动氧化应激的关键靶点【2】。现有抗氧化疗法依赖外源抗氧化剂，稳定性差、易干扰肠道菌群，小分子 NOX 抑制剂普遍特异性不足、存在全身毒性，临床转化受限【3-4】。CRISPR-Cas9 基因编辑可精准沉默致病基因，但胃肠道强酸、消化酶会快速降解 Cas9 核糖核蛋白（RNP），缺乏安全高效的口服递送体系，极大限制肠道局部基因编辑应用。益生菌大肠杆菌 Nissle 1917（EcN）无致病毒力因子，可定植肠道、调控黏膜免疫，是天然口服递送载体，其搭载CRISPR-Cas9系统，有望实现肠道原位精准基因编辑。

近日，辽宁大学毕秀丽团队在Cell Reports Medicine发表题为CRISPR-Cas9-producing probiotic bacteria for editing NOX2/gp91phoxand treating inflammatory bowel disease的研究论文。该研究构建IPTG诱导型CRISPR-Cas9工程EcN菌株，通过透明质酸/壳聚糖/镁离子复合水凝胶封装形成EcN-RNP@HCMg，实现口服靶向肠道炎症部位、时空可控沉默NOX2/gp91phox。该体系通过抑制NOX2/gp91phox大幅下调ROS，激活NRF2抗氧化通路、重编程脯氨酸-谷氨酸代谢提升谷胱甘肽储备，同步重塑肠道菌群稳态，在细胞与结肠炎小鼠模型中展现优异的IBD治疗效果。

研究团队首先通过单细胞转录组分析发现，溃疡性结肠炎（UC）、克罗恩病（CD）患者病灶中 NOX 家族基因显著上调，NOX2 是氧化应激与炎症通路核心驱动基因，确立 NOX2/gp91phox 为基因编辑靶点。研究人员构建质粒表达系统，经转化、PCR 验证获得稳定表达 Cas9 RNP 复合物的 EcN-RNP 工程菌。利用带负电透明质酸（HA）、正电壳聚糖（CS）与 Mg²⁺静电交联包裹细菌，形成生物相容性可注射水凝胶。Zeta 电位、扫描电镜实验证实复合水凝胶成功包裹 EcN。

为实现口服递送可控激活，研究采用 Lac 操纵子调控 Cas9 表达，IPTG 特异性启动 Cas9 转录，无 IPTG 时几乎无 Cas9 表达，大幅降低脱靶风险。体外胃肠液模拟实验显示，未封装的 EcN-RNP 在模拟胃肠液中存活率仅 0.07%，而 EcN-RNP@HCMg 存活率提升至 12%，水凝胶物理屏障抵御消化环境降解。体外肠道冲洗、活体荧光成像实验证实，水凝胶可借助 HA 特异性结合炎症巨噬细胞表面 CD44 受体，靶向富集于肠道损伤区域，肠道滞留量较裸菌提升近 100 倍，36 小时肠道荧光信号强度高出 20 倍。

细胞层面实验选用 LPS 诱导 RAW264.7 巨噬细胞、H₂O₂刺激 Caco-2 肠上皮细胞构建模型。DCFH-DA 荧光探针检测结果显示，IPTG 诱导的 EcN-RNP@HCMg 处理组细胞 ROS 水平下降 88%。活死细胞染色证实该体系可将氧化应激诱导细胞死亡率从 88.19% 降至 5.72%。qPCR 结果表明，EcN-RNP@HCMg 可显著下调促炎因子，上调抗炎因子。对比钙离子交联水凝胶（EcN-RNP@HCCa），Mg²⁺体系可将细胞 NOX2/gp91phox 表达抑制至 44%，编辑效率、ROS 清除、炎症调控能力全面更优。Mg²⁺作为 Cas9 催化辅因子，可显著提升基因编辑效率。

研究进一步在 DSS 诱导小鼠结肠炎模型验证体内治疗效果。结果显示EcN-RNP@HCMg+IPTG 组小鼠体重显著回升，第 10 天体重降幅仅 10.52%，远低于模型组 25.82%。疾病活动指数（DAI）降至 0.33，生存周期显著延长。结肠组织表型检测显示该组小鼠结肠长度完整、无充血水肿与出血，H&E 染色显示肠道隐窝结构完整、深度恢复，Masson 胶原染色证实肠道炎症显著缓解。肠道紧密连接蛋白 Claudin-1、ZO-1 表达回升，上皮屏障损伤得到修复，各脏器组织切片无异常，证明该体系体内生物安全性良好。

机制探究揭示两条核心保护通路，第一，NRF2 依赖抗氧化防御轴激活。NOX2/gp91phox基因沉默直接解除 ROS 对 NRF2 转录因子的抑制，上调下游 HO-1、GPX4 抗氧化蛋白表达。体外巨噬细胞中 NRF2、HO-1、GPX4 蛋白分别提升 26%、23%、28%，小鼠结肠组织中三者上调 21%、43%、10%，持续清除过量 ROS，阻断氧化应激级联反应。第二，脯氨酸-谷氨酸代谢重编程提升谷胱甘肽（GSH）储备。NOX2/gp91phox抑制后细胞下调脯氨酸合成关键酶 P5CS、PYCR1，上调脯氨酸分解酶 PRODH、P5CDH，促进脯氨酸转化为谷氨酸。谷氨酸是GSH前体，细胞与肠道组织内 GSH 含量显著回升，持续为 GPX4 提供底物，形成长效抗氧化循环。

该研究建立了口服益生菌原位表达CRISPR系统通过基因编辑治疗IBD的新策略，以益生菌 EcN 为基因编辑载体，HA/CS/Mg²⁺复合水凝胶包裹EcN解决口服递送稳定性与炎症靶向难题，IPTG 诱导实现时空可控编辑、降低脱靶风险。体系通过直接敲低 ROS 源头 NOX2/gp91phox，同步激活 NRF2 抗氧化通路、重编程氨基酸代谢、修复肠道屏障、重塑肠道菌群，多通路协同缓解 IBD 病理损伤。相较于小分子 NOX 抑制剂和游离抗氧化剂，该方案从根源阻断 ROS 生成，作用稳定、全身副作用低，具备优秀临床转化潜力。

辽宁大学毕秀丽教授为本论文通讯作者，辽宁大学张晨为论文第一作者，麦吉尔大学 Xiang-Jiao Yang 教授参与研究。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xcrm.2026.102940

制版人：十一

参考文献

1. Liu, H., Sun, J., Wang, M., Wang, S., Su, J., and Xu, C. (2023). Intestinal organoids and organoids extracellular vesicles for inflammatory bowel disease treatment. Chem. Eng. J.465, 142842.https://doi.org/10.1016/ j.cej.2023.142842.

2. Bao, S., Carr, E.D.J., Xu, Y.-H., and Hunt, N.H. (2011). Gp91phox contributes to the development of experimental inflammatory bowel disease. Immunol. Cell Biol.89, 853–860. https://doi.org/10.1038/icb.2011.4.

3. Xu, M., Xin, W., Xu, J., Wang, A., Ma, S., Dai, D., Wang, Y., Yang, D., Zhao, L., and Li, H. (2025). Biosilicification-mimicking chiral nanostructures for targeted treatment of inflammatory bowel disease.Nat. Commun.16, 2551. https://doi.org/10.1038/s41467-025-57890-8.

4. Zang, J., Felix, P., Yves, C., Cifuentes-Pagano, E., Hissabu, M.M.S., Dustin, C.M., Svensson, L.H., Olesen, M.M., Poulsen, M.F.L., and Jacobsen, S. (2023). Targeting NOX2 with bivalent small-molecule p47phox- p22phox inhibitors. J. Med. Chem. 66, 14963-15005. https://doi.org/10. 1021/acs.jmedchem.3c01548.

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