ADC中酶促偶联技术的研究进展

引言

抗体药物偶联物（ADC）构成了一类靶向治疗药物，它们利用单克隆抗体的特异性和细胞毒性药物的高效力，在有限的全身副作用下选择性地消除癌细胞。靶向细胞毒性的概念基础最初由Paul Ehrlich在1913年作为“魔法子弹”理论提出。随着抗体发现、蛋白质工程、连接子化学和有效载荷设计方面数十年的进展，最终2000年首个ADC药物吉妥珠单抗奥唑米星（Mylotarg）获批用于CD33阳性急性髓系白血病，随后又有16款获批的ADC和数百种候选药物在多种肿瘤适应症中注册进行临床试验。

通过ADC拓宽小分子药物治疗窗口的目标，包括降低最小有效剂量和提高最大耐受剂量，已得到动物数据的强力支持。然而，由于非特异性药物偶联，ADC异质性是阻碍从临床前研究成功临床转化的关键因素之一。ADC中区域异构体和药物抗体比的广泛变异可导致不同的药代动力学、降低的治疗指数和不可预测的毒性特征。因此，具有确定DAR和药物附着位点的ADC越来越被认为能提供更优的治疗结局。

定点偶联策略包括化学方法、亲和肽导向的Fc修饰和酶促生产，每种方法都有其独特的优势和局限性。使用生物正交反应和工程化氨基酸残基的化学策略提供了多功能性和可扩展性，但可能需要大量优化以平衡化学反应性与抗体完整性。引入突变、非天然氨基酸和重建的二硫键也带来抗体支架稳定性、亲和力、特异性、免疫原性和生物相容性改变的风险。亲和肽导向的Fc修饰利用具有Fc结合选择性的短肽来引导在特定位点的化学偶联。类似地，亲和配体可以引导有效载荷与抗体形成非共价相互作用以产生均质性ADC。这种基于亲和力的方法提高了选择性，减少了偶联位点异质性，且无需抗体的基因工程，同时保持相对简单的反应条件。然而，亲和肽/配体的使用面临结合结构域的要求、偶联有效载荷数量和位置限制以及有效载荷附着时潜在结合亲和力降低的问题。相比之下，酶促方法利用蛋白质催化剂的内在选择性，在温和条件下实现精确修饰，并具有已证实的基因可编码性、催化周转性、正交性、模块化和生物相容性。

酶介导的偶联已成为一种强大的策略，用于生成具有确定DAR以及增强的药代动力学、安全性和有效性特征（与传统化学方法相比）的定点ADC。从机制上讲，这些偶联工具分为两种主要作用模式：与药物分子形成共价键的自标记标签，以及识别肽基序以安装有效载荷的催化机器。开发平台也可根据酶来源（细菌、古菌、真菌、植物和哺乳动物）进行分类，反映了为实现受控、选择性和生物相容性偶联而利用的广泛催化反应。

一、细菌酶

微生物转谷氨酰胺酶是一种不依赖钙离子的酰基转移酶，可在谷氨酰胺残基与伯胺之间形成异肽键。作为一种小型单结构域酶，MTGase比哺乳动物转谷氨酰胺酶更易于生产和体外应用。用于生成ADC的最常见MTGase来源于Streptomyces mobaraensis。MTGase中的活性位点半胱氨酸可攻击去糖基化IgG上的Gln295，形成硫酯中间体，然后与携带有效载荷-连接子的亲核胺反应。所得均质性ADC的DAR为2。通过基因工程，该系统可从完全糖基化的抗体、抗原结合片段、单链可变片段以及重链可变结构域生产ADC。然而，MTGase可交联内源性谷氨酰胺和赖氨酸残基，产生高分子量物质，使ADC生产复杂化。通过完全去除C末端赖氨酸（一个主要的交联位点），可显著降低最终产品中高分子量变体的水平。该平台也可用于两步化学酶促过程，其中MTGase首先催化性地向抗体添加一个间隔基，然后通过点击化学安装连接子-有效载荷。MTGase被FDA认定为一般认为安全的物质，并因其在广泛温度和pH范围内工作而广泛应用于食品工业。3期ADC候选药物DP303利用MTGase介导的含胺MMAE与靶向人表皮生长因子受体2的单克隆抗体Gln295位点的偶联，并展现出高稳定性、良好的药代动力学和强效性。

内切糖苷酶如来自Streptococcus pyogenes的Endo-S和Endo-S2是水解酶，可切割宿主IgG抗体上壳二糖核心两个N-乙酰葡糖胺残基之间的Fc N-聚糖，作为逃避免疫清除的机制。为了促进药物偶联，ENGase被工程化，可高效去除天然N-聚糖并将带有功能化标签的合成聚糖转移到抗体的暴露GlcNAc残基上，且不水解所得转糖基化产物。内切糖苷酶与糖基转移酶在Synaffix的GlycoConnect技术中相结合，以生产IBI343（一种携带依沙替康的抗Claudin抗体，DAR=4）。该药物在多项1期临床试验中显示出有前景的活性，并正在推进至胃癌的3期研究。

甲酰甘氨酸生成酶识别一个包含半胱氨酸的短肽基序，并将其氧化为甲酰甘氨酸——一种在所有生命领域中保守的翻译后修饰。来自Mycobacterium tuberculosis和Streptomyces coelicolor的细菌FGE已被充分研究，并已成为抗体偶联中的重要工具。对于融合了CXPXR序列的抗体，FGE会生成一个具有独特醛基官能团的甲酰甘氨酸残基，用于有效载荷的定点化学附着。几种生物偶联化学方法，包括肼基-异-Pictet-Spengler偶联和Knoevenagel连接，已被优化用于将含肼和吡唑啉酮的细胞毒性药物附着到这些醛位点上，分别产生确定的药物与醛标签比为1:1和2:1的偶联物。使用这种方法，已生成了靶向表皮生长因子受体和CD22的ADC。TRPH-222是一种通过FGE策略将美登素偶联到CD22靶向抗体上的ADC，在B细胞淋巴瘤的1期临床研究中显示出令人鼓舞的结果。

Sortase A是一种属于半胱氨酸蛋白酶家族的半胱氨酸转肽酶，主要存在于革兰氏阳性菌（如Staphylococcus aureus）的膜中。它催化工程化的带有五肽识别基序LPXTG的抗体与携带N端寡甘氨酸基序的药物连接子之间的转肽反应，产生均质性ADC。在SrtA催化过程中，其Cys184残基与LPXTG基序之间形成硫酰基-酶中间体，随后由(Gly)n-有效载荷底物的氨基进行亲核攻击，完成药物偶联并释放SrtA。通过SrtA介导偶联生产的靶向受体酪氨酸激酶样孤儿受体1的ADC NBE-002已进入临床试验。

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶是细菌脂肪酸和非核糖体肽合成中激活酰基-和肽基-载体蛋白所必需的酶，它通过将4'-磷酸泛酰巯基乙胺基团从辅酶A转移到ACP和PCP结构域的保守丝氨酸残基上来发挥作用。为了利用PPTases进行生物偶联，Walsh等人开发了可被PPTases识别的11和12个残基的短肽标签，避免了融合80-100个残基的大型ACP和PCP结构域的需求。在PPTases中，来自Bacillus subtilis的Sfp和来自Escherichia coli的AcpS是生物工程应用中研究最广泛的。Sfp在识别短肽标签和偶联多种CoA衍生物方面表现出卓越的效率。Grünewald等人将相同的11和12聚体标签插入曲妥珠单抗的不同环区，用于Sfp催化的澳瑞他汀偶联。所生产的95种均质性ADC几乎都对HER2阳性细胞系显示出亚纳摩尔效价，而那些在重链恒定区1携带有效载荷的ADC则显示出良好的药代动力学特征。

脂酸连接酶A来自E. coli，是一种ATP依赖性连接酶，可催化脂酸的脱酰化，然后将其转移到其天然蛋白底物的赖氨酸残基上。在生物偶联背景下，已开发出一个13个残基的脂酸接受肽用于基因融合到抗体中，并被LplA识别，在赖氨酸侧链与脂酸羧基之间生成酰胺键。已创建了LplA变体以改善连接活性和对脂酸衍生物的底物混杂性。通过LplA在LAP标签上安装修饰的脂酸后，可通过生物正交反应附着细胞毒性有效载荷。有趣的是，最近的研究确定IgG1中的Lys188适合由LplA进行优先修饰，而无需LAP标签，从而产生了抗HER2和抗CD20的ADC。此外，LplA与MTGase结合使用，可在曲妥珠单抗的不同位点上偶联两种不同的荧光有效载荷。

二、古菌、真菌和植物酶

生物素连接酶存在于多种物种中，包括细菌、古菌（Pyrococcus horikoshii）和真菌（Saccharomyces cerevisiae），催化两步ATP依赖性反应，其中生物素被转移到生物素受体结构域的特异性赖氨酸残基上。已开发出可点击的生物素类似物，用于酵母和古菌生物素连接酶的催化。为了生成定点ADC，将来源于人丙酰辅酶A羧化酶α亚基C端序列的p67标签基因融合到抗HER2曲妥珠单抗轻链或重链的C端。在通过P. horikoshii生物素连接酶将脱硫生物素-叠氮化物定点修饰该抗体融合标签后，通过应变促进的叠氮-炔环加成反应共价附着MMAE细胞毒性有效载荷。尽管具有高特异性和与生物正交化学的兼容性，但该模块化平台受限于ATP依赖性、与其他连接酶相比更慢的催化周转以及需要表达相对较大的p67识别序列。

酪氨酸酶来源于真菌（如Agaricus bisporus）和细菌（如Bacillus megaterium），已作为定点生物偶联的酶促工具被使用，通过在温和有氧条件下将酚类氧化为高反应性邻醌。它们可以将Fc结构域（如Tyr296）上的表面酪氨酸残基转化为邻醌基团，用于随后与功能化有效载荷的偶联；或者将酚-药物衍生物转化为反应性邻醌中间体，与抗体上存在的苯胺、脯氨酸和硫醇进行偶联。Cao等人使用酪氨酸酶将酚标记的MMAE与携带工程化半胱氨酸的抗HER2抗体偶联，合成了DAR为2-4的ADC。虽然酪氨酸酶辅助偶联允许在温和条件下进行位点特异性反应，且无需基因掺入非天然氨基酸，但只有表面可接触或工程化的酪氨酸残基适用于这种方法。除了潜在的脱靶氧化或副反应外，生成的醌中间体可能导致交联或不需要的反应性，需要进一步研究和优化以用于ADC开发。

肽天冬酰胺连接酶是天冬酰胺内肽酶家族的植物成员。来自Clitoria ternatea的Butelase-1和来自Viola yedoensis的VyPAL2已被广泛研究用于蛋白质工程。PAL催化的反应涉及识别三肽基序、切割Asn残基后的肽键、形成硫酰基-酶中间体，以及与另一肽段的N端连接，高效且最小水解地产生新肽键。它们在生物偶联中的关键优势包括快速反应动力学、短识别序列，以及几乎无痕的修饰（连接后目标蛋白上只留下一个Asn残基）。PAL已用于工程化具有双功能的蛋白质和肽。例如，通过Butelase-1和VyPAL2的串联连接，可以将EGFR靶向的亲和体共价标记上荧光标签和细胞毒性肽。该方法还使亲和体环化并随后进行阿霉素偶联。来自Singzyme的PAL技术衍生的ADC正处于针对不同癌症的临床前开发中。

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三、哺乳动物/人源酶

法尼基转移酶是在真核生物中发现的异二聚体异戊二烯基转移酶。目前，特征最明确的FTase来源于哺乳动物和酵母。FTase催化将15碳法尼基异戊二烯从异戊二烯供体法尼基焦磷酸转移到含有Cys-脂肪族-脂肪族-X基序的蛋白底物上，与CaaX的半胱氨酸残基形成稳定的硫醚键。工程化带有可接触CaaX基序的抗体或抗体片段，可在存在叠氮基或炔基功能化法尼基类似物的情况下，通过FTase安装可点击手柄，随后通过点击化学与细胞毒性有效载荷偶联。FS-1502是一种由FTase平台开发的携带单甲基澳瑞他汀F的抗HER2 ADC，在HER2阳性癌症患者的1a/1b期试验中显示出有前景的抗肿瘤活性和低毒性，并已进入3期临床研究。基于FTase的ADC方法具有高特异性偶联、稳定的硫醚键、生物相容性条件以及对抗体结构影响最小的特点。

哺乳动物糖基转移酶，特别是β-1,4-半乳糖基转移酶和唾液酸转移酶，允许将反应性糖类（如叠氮基或酮基修饰的单糖）掺入Asn297处保守的Fc N-聚糖中，提供生物正交手柄而不改变抗体骨架。几项临床前研究证明了通过GalT介导的聚糖重塑高效添加叠氮基或炔基基团，用于附着细胞毒性有效载荷和荧光团。这种糖工程策略产生了可选择性杀伤癌细胞的抗CD22-阿霉素和抗HER2-MMAE的定点偶联物。通过将工程化内切糖苷酶与天然糖基转移酶结合，GlycoConnect技术促进将6-叠氮基-N-乙酰半乳糖胺转移到Fc聚糖上，通过无金属环加成反应实现有效载荷偶联，产生与传统偶联方法相比具有改善安全性和药代动力学的稳定定点ADC。由GlycoConnect平台开发的ADC目前正处于1期和3期研究。虽然这种偶联策略通过空间上远距离、高度保守且化学性质独特的聚糖位点，对抗原结合几乎没有影响，但在30-37°C下延长孵育以及对Fc聚糖的修饰可能会影响药代动力学特征和与Fc受体的相互作用，需要在ADC开发过程中进行进一步评估。

微管蛋白酪氨酸连接酶是一种翻译后ATP依赖性酶，在所有哺乳动物中广泛保守。它催化将酪氨酸添加到α-微管蛋白的C端，生成酪氨酸化微管蛋白，对调节微管稳态至关重要。通过使用TTL，酪氨酸衍生物成功通过融合在C端的Tub-tag（模拟α-微管蛋白的TTL识别序列）附着到抗GFP纳米抗体上。基于此酶促平台，TTL已被应用于开发针对造血系统恶性肿瘤的CD30特异性ADC。TUB-010是一种携带MMAE有效载荷的抗CD30 ADC，在CD30阳性淋巴瘤的啮齿动物和非人灵长类动物模型中，以等效MMAE剂量给药时，与Adcetris相比展现出更优的肿瘤控制，同时改善了耐受性。

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四、高度工程化的酶

SNAP-tag是人O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的修饰版本，可催化性地将烷基从DNA的O6鸟嘌呤转移到活性位点的Cys145，以修复DNA损伤。通过噬菌体展示辅助筛选，鉴定出AGT变体，其尺寸减小、对O6-苄基鸟嘌呤类似物的活性增强，并与内源性DNA的相互作用最小化。通过将SNAP-tag融合到抗体片段上，苄基鸟嘌呤衍生的细胞毒性药物可以1:1的化学计量比共价附着。SNAP标记的抗EGFR和HER2 scFv与澳瑞他汀F有效载荷偶联后，在纳摩尔水平显示出对乳腺癌细胞系的强效活性。基于SNAP-tag的偶联迄今已应用于scFv抗体，而非全长IgG。它提供了偶联后无需去除酶的实际优点。相关的自标记系统HaloTag，融合了工程化的细菌卤代烷脱卤酶，以类似的不逆方式运作，但尚未用于生成ADC。

SpyLigase是一种源自S. pyogenes的CnaB2结构域的工程化酶，被分成SpyTag、KTag和SpyLigase片段。SpyTag中的天冬氨酸残基和KTag中的赖氨酸残基的侧链可在SpyLigase催化下，在温和水性条件下形成稳定的异肽键。使用携带C端融合SpyTag的抗EGFR抗体和MMAE-KTag肽，大肠杆菌表达的SpyLigase合成了一种均质性ADC，偶联效率约80%，DAR约1.7，并对EGFR阳性癌细胞显示出亚纳摩尔细胞毒性。尽管SpyTag和KTag很小，且SpyLigase不整合到最终偶联物中，但它主要被工程化以有利于稳定组装而非快速释放，导致周转率低，需要相对于底物多摩尔当量的酶。受细菌CnaB2型结构域启发的类似技术包括SpyCatcher、SnoopLigase和SnoopCatcher，但尚未应用于ADC开发。

内含肽存在于细菌、古菌和真核生物中，通过自剪接或反式剪接，以天然肽键连接两个蛋白质片段。通过将整个内含肽基因融合到抗体上，表达的蛋白质连接策略可以生成硫酯中间体，用于附着合成肽。基于这种方法，可以以60%的产率生产免疫偶联物。通过内含肽将MMAF偶联到抗HER2抗体上，可在小鼠乳腺癌异种移植模型中有效抑制肿瘤生长。虽然基于内含肽的偶联方法在ADC上留下最小的标签残基，但它需要维持还原性环境进行反应，导致重组表达复杂性增加且产率一般。

Trypsiligase来源于大鼠胰蛋白酶II，具有抑制蛋白水解同时增强连接酶/转肽酶活性的突变。通过识别YRH基序并切割酪氨酸和精氨酸残基之间的肽键，trypsiligase催化形成酰基-酶中间体，随后将带有酰基供体的第二肽连接至暴露的N端或C端。将YRH序列融合到抗HER2 Fab抗体的C端后，可通过trypsiligase合成具有细胞毒性有效载荷的均质性ADC。与其他酶促方法相比，trypsiligase需要较短的识别标签用于偶联反应。

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结语

酶催化偶联技术为改善ADC的精确性和均质性提供了强大的帮助，这反过来又能增强批次控制、简化产品规格、提高临床和质量重现性，并促进监管批准。然而，它们的更广泛临床转化仍面临若干挑战。一个潜在问题是源自非人源酶编码的肽标签或化学连接的免疫原性。此外，带有识别标签和/或酶促修饰的抗体结构的改变可能影响分子稳定性、生物活性、生物分布或清除特征。因此，在临床前开发和临床转化过程中必须仔细评估这些因素。

制造和工艺开发需要为酶促偶联技术考虑额外因素。与传统偶联方法相比，基于酶的策略可能引入新材料和工艺步骤，如生物催化剂、辅因子、工程化识别标签和专门的连接子-有效载荷底物。这些要求可能增加工艺复杂性，并对反应优化和供应链管理施加额外限制。可扩展生产进一步要求精确控制酶促反应参数，包括酶浓度、反应时间和纯化程序，以确保一致的偶联效率并最小化产品相关杂质。

除了肿瘤学，酶相关技术可能促进携带标记试剂或非细胞毒性有效载荷（如免疫调节剂、抗菌化合物和酶抑制剂）的抗体偶联物的生成。它可以将抗体相关偶联物扩展到感染性疾病、炎症性疾病和代谢性疾病的诊断和治疗。此外，酶促策略可应用于非抗体蛋白和双特异性偶联物的定点偶联。

参考资料：

The evolving landscape of enzymatic technologies for precision synthesis of antibody-drug conjugates. Antib Ther. 2026 Apr 29;9(3):259-272.