《食品科学》：北京工商大学吴继红副教授等：基于Caco-2细胞转录组测序解析黄水多糖保护肠道屏障的活性机制

肠道不仅是机体的消化器官，也是最大的免疫器官。完整的肠道屏障可以吸收水分和营养物质，同时阻止毒素、细菌和其他有害物质通过肠道上皮细胞进入血液。当机体处于感染、炎症、外伤等病理状态时，这种平衡就会被打破，随之而来的是肠道屏障的完整性被破坏，通透性增加，使肠道内以脂多糖（LPS）为代表的内毒素通过血管或淋巴系统进入体循环，诱发炎症反应，加重肠道屏障功能损伤，进而导致一系列肠道疾病，如炎症性肠病（IBD）。虽然临床上已经使用了各种治疗肠道疾病的药物，但都存在相关的副作用，如皮质类固醇引起的面部肿胀、痤疮等，免疫调节剂（巯基嘌呤和硫唑嘌呤）引起的过敏反应、恶心、肝功能受损和胰腺炎等，为IBD患者带来了更重的负担。因此，需要开发效果好、副作用小的新疗法（如天然产物）。目前，多糖由于具有抗氧化、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等生物活性以及较小的副作用，已被广泛用作治疗不同疾病的辅助剂。近年来，RNA测序（RNA-seq）技术在功能成分如多糖的活性机制和分子调节通路方面的应用已经逐渐成熟。具体来说，RNA-seq用于分析转录组的结构，能够提取广泛的基因本体、基因融合、编码序列的多态性以及非编码序列的功能等。它是揭示特定生物学过程以及疾病发生过程中潜在分子机理的重要工具，例如Xiang Quandan等通过RNA-seq阐释了黑灵芝多糖PSG-1对纯化的T淋巴细胞的免疫调节作用机制，发现其主要通过Ca2+/CaN和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路起重要作用。

在前期研究中，从黄水中分离纯化得到一种葡聚糖WLY-0，并发现其具有肠道屏障保护功能，能够逆转LPS诱导的跨上皮电阻（TEER）值降低和异硫氰酸荧光素-葡聚糖4（FD-4）通量增加，并且能够通过提高紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1、胞质紧密连接蛋白-1（ZO-1）和连接黏附分子A（JAM-A）的表达起到缓解LPS造成的Caco-2细胞单层模型屏障功能障碍，但是具体的机制仍不清晰。此前有研究发现，通过发酵玉屏风多糖上调胃肠道TLR2和TLR4的mRNA表达水平，可以改善断奶獭兔的肠道屏障完整性和功能，从而增强其免疫力。同样，霍山石斛中提取的多糖已被证明能显著提高白细胞介素-12（IL-12）的释放，并通过Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）依赖通路与肠上皮细胞相互作用，从而调节肠上皮细胞的免疫应答。目前多糖对于肠屏障损伤的研究多基于已知的通路对其进行验证，而对于潜在的一些分子机制的发现鲜有报道。

因此，北京工商大学中国轻工业酿酒分子工程重点实验室，食品质量与安全北京实验室的吴紫妍、霍嘉颖、吴继红*等在前期已明确WLY-0具有肠道屏障保护活性的基础上，基于RNA-seq技术探讨WLY-0对肠道屏障的保护作用机制，以RNA-seq为基础，结合多种分子生物学技术，对WLY-0肠屏障保护活性的潜在分子机制进行深入研究，以期为实现黄水的高附加值利用提供理论基础。

1 转录组分析

1

1.1 DEGs的可视化

DEGs分析旨在找出不同处理组（对照组（Con）：未加多糖和LPS；LPS组：仅加LPS；LPS_SW：先加WLY-0预处理后加LPS孵育）之间Caco-2细胞基因表达的区别，从而阐明WLY-0保护肠道屏障的潜在机制。本研究用Deseq R软件包分析了3 组9 个样本的表达谱，并用火山图展示了各组筛选出的DEGs数目，具体如图1所示，LPS_SW组与LPS组相比有334 个DEGs，其中下调基因208 个，上调基因126 个。此外，与对照组相比，LPS组共鉴定出333 个DEGs，其中170 个上调，163 个下调。

由图2可知，经WLY-0预处理后，74 个DEGs被逆转，其中35 个被LPS上调的基因在WLY-0干预下表达下调，39 个被LPS下调的基因在WLY-0干预后表达上调。因此，这74 个基因可能是WLY-0激发的肠屏障损伤的治疗靶点。

热图直观地展示了各样本中各基因的表达及各组间基因表达的差异，以及LPS_SW vs LPS和LPS vs Con之间的共有DEGs（图3），并通过层次聚类分析发现LPS_SW组和Con组可以被归为一组，说明经多糖预处理的细胞内基因表达与对照组类似，但与LPS组不同。

1.2 GO功能注释和KEGG富集分析

为对DEGs进行详细分析，对在2.1.1节中得到的DEGs进行GO分析，GO（http://www.geneontology.org/）是基因本体论联合会建立的数据库，其目的在于标准化不同数据库中的关于基因和基因产物的生物学术语，对基因和蛋白功能进行限定和描述。利用GO数据库，可以将基因按照它们参与的生物过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）进行分类。如图4所示，对于WLY-0处理组细胞，74 个重叠的DEGs主要富集在BP细胞连接组装与组织过程中，这些DEGs编码的蛋白主要分布在整个细胞膜和细胞器膜中。MF分析表明，这些DEGs参与调控通道活性和被动跨膜转运蛋白活性。

除GO分析外，还进行了KEGG富集分析，以揭示WLY-0对肠屏障保护作用的潜在机制。KEGG是系统分析基因功能和基因组信息的数据库，它帮助研究人员将基因和表达信息看作一个整体网络进行研究。作为通路分析相关的一个主要公共数据库，KEGG提供了整合的代谢通路查询功能，包括碳水化合物、核苷酸、氨基酸等的代谢和生物降解有机物。它不仅提供了所有可能的代谢路径，还对催化反应的酶进行了全面的注释，包括氨基酸序列和PDB库的链接。KEGG是进行生物体内代谢分析和代谢网络研究的有力工具。通过KEGG数据库，可以将基因根据参与的通路或发挥的功能进行分类，并针对两两分组的DEGs，在其中一个样本作为对照的情况下，在KEGG通路图上显示DEGs。LPS_SW与LPS中DEGs的KEGG富集分析如图5A所示，其DEGs主要富集于MAPK信号通路，而且对WLY-0预孵育逆转LPS诱导改变的重叠基因也进行了KEGG富集分析，如图5B所示，同样主要富集于MAPK信号通路。这说明WLY-0对肠屏障的治疗靶点基因主要与MAPK信号通路相关。

1.3 DEGs的验证

从WLY-0逆转的74 个基因中筛选出与炎症相关的4 个基因（MyD88、IRAK4、LTB4R、TIAF1）和与紧密连接（TJs）功能相关的2 个基因（GRHL2和PRKCI），对此6 个基因进行PCR验证。结果如图6所示，PCR结果与转录组表达结果一致。与LPS组相比，对照组和LPS_SW组炎症相关基因MyD88、IRAK4、LTB4R和TIAF1显著下调，而TJs相关基因GRHL2和PRKCI则被WLY-0显著上调，证明转录组结果准确可靠。值得注意的是，GRHL2作为上皮屏障分化和修复的核心转录因子，可直接调控Occludin等紧密连接蛋白的表达。PRKCI则参与细胞极性的建立，对维持屏障完整性至关重要。WLY-0能够显著逆转LPS对这2 个基因的抑制，表明其屏障保护作用不仅源于抗炎效应，更与直接上调屏障核心基因的表达有关。上述DEGs验证结果表明，WLY-0可能通过调控MAPK信号通路影响炎症及屏障相关基因的表达。基于此，后续进一步通过Western blot对MAPK信号通路关键蛋白进行分析。

2 WLY-0对Caco-2细胞MAPK信号通路的影响

2

进一步研究各组3 个MAPK家族成员细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38的表达量。如图7所示，相比对照组，LPS可使p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK水平分别升高373.12%、309.09%和41.00%，但在WLY-0干预后呈现不同的变化趋势。WLY-0处理组与LPS组相比，WLY-0能够显著抑制p-p38/p38和p-JNK/JNK的水平，而升高p-ERK/ERK比值（P＜0.05）。p38与JNK作为典型的促炎信号轴，可促进TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，而ERK通路则在多种模型中显示出抗炎与组织修复功能，这与本研究结果一致。同时在实验中验证了WLY-0对TLR4与MyD88表达量的影响，以此确定其是否通过TLR4/MyD88/MAPK信号通路调节细胞的炎症。LPS可显著上调TLR4和MyD88的表达，但是与LPS组相比，WLY-0对TLR4的表达没有显著影响（P＞0.05），表明TLR4不是WLY-0调控MAPK信号转导的主要分子媒介。结合上述结果，说明WLY-0对MAPK信号通路的调控作用更为显著，其调控细胞炎症并非依赖TLR4/MyD88/MAPK信号通路实现，这与KEGG富集分析的结果一致。

随后，对下游的促炎因子和抑炎因子的相对mRNA表达量也进行了测定（图8），发现WLY-0显著抑制了促炎因子IL-6、TNF-α和IL-8 mRNA相对表达量的升高（分别降低53.34%、44.56%和37.16%），促进了抑炎因子IL-10和IL-37的释放（mRNA相对表达量分别升高5.96 倍和18.54 倍），进一步说明WLY-0能够通过调节MAPK信号通路调节LPS引起的细胞内炎症。

3 讨 论

3

为进一步阐明WLY-0保护肠屏障功能的可能机制和途径，本研究采用RNA-seq技术分析了WLY-0预处理组与单纯LPS组（LPS_SW vs LPS）、LPS组与对照组（LPS vs Con）的DEGs。RNA-Seq又称转录组全测序，是近年来发展起来的利用深度测序技术获取转录组基因信息的技术。作为揭示疾病发生过程中特定生物学过程和潜在分子机制的重要工具，RNA-seq已被广泛应用于探索天然活性成分的生理活性机制。

DEGs分析结果显示，与对照组相比，LPS处理后MyD88和IRAK4显著上调，而WLY-0预处理则显著逆转了它们的过度表达。MyD88是TLRs的一个重要的衔接蛋白，是一种模式识别受体。TLRs介导的MyD88信号转导途径是TLRs信号转导的主要途径，包括依赖性MyD88信号转导途径和独立性MyD88信号转导途径。依赖性的MyD88通路被TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6等受体激活，导致促炎细胞因子的产生，IRAK1、IRAK4和TRAF6的募集以及IRAK1的磷酸化。进一步通过KEGG富集分析发现，LPS_SW组和LPS组间的DEGs主要富集于MAPK信号通路。且WLY-0和LPS反向调控的重叠基因同样在MAPK信号通路中富集。因此，推测WLY-0保护肠道屏障的分子机制主要涉及MAPK信号通路。

MAPK信号通路家族主要包括ERK1/2、JNK1/2/3、p38和ERK5 4 个级联通路，与炎症的发展和TJs的破坏有关。先前研究发现，p38信号通路可以调节组织中的TJs。Wip1作为一种MAPK激酶抑制剂，可使p38脱磷失活。在Caco-2单层细胞氧化应激模型中，Wip1的干预有效改善了H2O2引起的肠道通透性增加，表明氧化应激可能通过激活p38扰乱TJ蛋白的分布，进而破坏肠道屏障功能。在验证MAPK信号通路的关键作用时，本研究发现WLY-0可显著抑制p38和JNK的磷酸化，同时促进ERK的磷酸化水平。已有研究报道，p38和JNK作为应激相关信号通路，其过度激活可通过磷酸化作用下调Occludin等紧密连接蛋白的表达，直接损害上皮屏障功能；而ERK通路的激活则在多种模型中表现出促进上皮修复和增强屏障完整性的作用。这些发现与前期研究观察到的WLY-0改善屏障功能表型的结果高度一致，共同确立了MAPK信号轴在WLY-0保护机制中的 核心地位。

进一步整合转录组与实验验证数据发现，被WLY-0逆转的DEGs显著富集于细胞连接组装、被动跨膜转运蛋白活性等条目，从基因组层面解释了前期研究中观察到的WLY-0提升TEER、降低FD-4通透性以及上调Occludin、Claudin-1、ZO-1和JAM-A蛋白表达的功能表型，这些基因共同构成了维持屏障完整性的分子防线。值得注意的是，尽管KEGG分析提示MAPK为核心通路，TLR4/MyD88蛋白水平的检测结果显示，WLY-0并未显著抑制二者的表达。这一阴性结果表明，WLY-0对MAPK通路的调控可能不依赖于经典的TLR4/MyD88上游轴，其作用起点可能位于更下游或经由其他未知受体，凸显其作用模式的独特性，也为后续靶点探索提供了新方向。同时，PCR验证结果显示，WLY-0可调控IRAK4、LTB4R和TIAF1等基因的表达，提示其可能同时影响多个与炎症和细胞存活相关的平行信号网络，协同增强抗炎与屏障保护作用，反映天然多糖多靶点、多通路的作用特点。

本研究结果表明ERK通路激活在炎症缓解中具有积极作用，这与Met-Met化合物的报道一致。值得注意的是，WLY-0对MAPK通路的调节不依赖于TLR4受体，这与本课题组发现的另一种黄水多糖NLS-2（其作用依赖于TLR4/MyD88通路）形成鲜明对比。这种功能差异可能源于二者在组成和结构上的区别，具体的原因和构效关系还有待进一步探究。

4 结 论

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本研究主要采用RNA-seq等多种生物学技术探究黄水多糖WLY-0对肠屏障功能的保护作用机制。研究表明，WLY-0处理组与LPS组之间的DEGs富集于MAPK信号通路，WLY-0干预对TLR4蛋白的表达无显著影响，但当补充WLY-0时，p38和JNK的磷酸化被显著抑制，ERK的磷酸化水平被显著促进，下游促炎症因子TNF-α、IL-6和IL-8的mRNA表达降低，而抑炎因子IL-10和IL-37的mRNA表达增加。这些发现说明，WLY-0一方面通过调控MAPK信号通路发挥抗炎作用，另一方面直接作用于屏障相关关键基因，二者协同缓解LPS诱导的肠道屏障损伤。该结论为深入了解黄水多糖对肠道屏障的保护作用提供了新的见解，也为利用黄水多糖制备相关产品辅助治疗肠道炎症提供了理论依据。

作者简介

通信作者：

吴继红 副教授

主要从事酒类风味化学、白酒酿造副产物高附加值利用等方面的研究。近5 年主持国家自然科学基金1 项、企业横向项目2 项；以第一或通信作者发表SCI论文36 篇（热点论文2 篇）、EI论文6 篇；授权国家发明专利3 项；参编中、英文著作2 部。获中国食品科学技术学会科技创新奖一等奖2 项（分别排名第一、第二）、神农中华农业奖科学普及奖1 项（排名第六）；担任Journal of Food Composition and Analysis期刊客座主编、Journal of Future Foods青年编委。

第一作者：

吴紫妍 博士研究生

研究方向为酿酒黄水多糖的高值化利用，以第一作者（或导师一作，本人二作）在Journal of Cleaner Production、Food Chemistry等期刊发表SCI论文6 篇，EI论文1 篇，授权国家发明专利2 项。

引文格式：

吴紫妍, 霍嘉颖, 苏建, 等. 基于Caco-2细胞转录组测序解析黄水多糖保护肠道屏障的活性机制[J]. 食品科学, 2026, 47(7): 174-182. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251005-007

WU Ziyan, HUO Jiaying, SU Jian, et al. Mechanism of action of a polysaccharide isolated from Huangshui, a byproduct of Baijiu fermentation, in protecting the intestinal barrier identified by transcriptome sequencing based on Caco-2 cells[J].Food Science, 2026, 47(7): 174-182. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20251005-007

实习编辑：陈师昀；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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