浙江
RNA干扰技术是很有潜力的一种抗病毒策略，植物病害防控里已经用得很不错了，但到了畜禽养殖领域，就长期面临沉默效率不高和容易脱靶的问题。同时，怎么把双链RNA或者小干扰RNA经济又稳定地送进动物体内，也是个一直没解决好的大难题。2026年6月19日，南京农业大学杨倩教授、林建教授以及刘佳琛团队在《Trends in Biotechnology》上发表了一篇研究论文，论文标题是“Engineered Bacillus subtilis to deliver dsRNA via extracellular vesicles against the H9N2 avian influenza virus”，南京农业大学是第一完成单位。研究团队把益生菌的天然属性和RNA干扰技术结合到一起，他们构建了一种能持续表达抗病毒双链RNA的工程化枯草芽孢杆菌，再通过这种细菌分泌的胞外囊泡把双链RNA高效递送出去，在鸡体内成功抑制了H9N2亚型禽流感病毒的感染。
研究团队先从一个病毒来源小干扰RNA数据库里筛出了一段双链RNA，这段RNA有300个碱基对长，专门靶向H9N2病毒的NS1基因。这些病毒来源小干扰RNA是病毒感染宿主细胞时细胞自己产生的。他们选了公认安全的枯草芽孢杆菌168作为底盘菌，敲掉了菌里面的RNase III基因，这样双链RNA就不容易被降解掉了，然后他们又用双向启动子把这段靶标双链RNA的基因稳定地表达出来，得到了一个叫AAD的重组菌株。把AAD菌株口服喂给雏鸡以后，这种菌能在鸡的肠道里活至少7天，这期间它会一直不停地合成和释放大量的双链RNA分子。研究团队在鸡的血液、心脏、肝脏、肺和肾脏这些组织里都检测到了双链RNA，说明它们确实从肠道跑出去了。
研究团队还发现，枯草芽孢杆菌分泌的胞外囊泡就是递送双链RNA的关键载体。他们用温和的溶菌酶处理结合超速离心的方法，大大提高了囊泡的产量，并且确认了这些直径大概在80到200纳米的囊泡里面确实包着完整的靶标双链RNA。在细胞摄取实验里，他们用红色荧光染料标记了囊泡，结果发现鸡巨噬细胞在1小时内就能把这些囊泡高效地吞进去，吞进去的细胞比例比15分钟时高了将近10倍，这说明用囊泡来做口服递送载体是很有前途的。研究团队接着又发现，囊泡被细胞吞进去以后，里面带的双链RNA会被宿主细胞里的Dicer酶切成小干扰RNA，这些小干扰RNA再组装到RNA诱导沉默复合体里面，专门去沉默病毒的NS1基因。小RNA测序结果还显示，跟传统的脂质体转染办法比起来，用囊泡递送产生的小干扰RNA数量多了接近50倍，而且这些小RNA的长度和序列分布更广，几乎覆盖了整个300个碱基的靶标区域。同时，枯草芽孢杆菌的囊泡本身也能刺激宿主细胞，它激活了Toll样受体和I型干扰素相关的信号通路。这样，RNA干扰和天然免疫两路一起发力，病毒核蛋白的表达量下降了超过96%，病毒滴度也降了大约70%。研究团队为了证明囊泡是必不可少的，还专门做了一个lytC基因敲除的菌株，这个菌株产出的囊泡大大减少。结果在动物实验里，这个突变株完全失去了保护能力，这反过来证实了囊泡在递送过程中确实起着核心作用。
在针对SPF鸡的动物保护实验里，研究团队发现，不管是直接喂AAD活菌，还是口服纯化过的AAD囊泡，都能明显减轻H9N2感染造成的体重掉秤和肺部损伤，还能把呼吸道里的病毒量降下来。他们还用无关的传染性法氏囊病病毒去攻击喂了AAD的鸡，结果这些鸡一点保护效果都没有，这就说明AAD的抗病毒作用是序列特异的，不是靠非特异性免疫瞎蒙的。这个平台现在的技术成熟度已经到了第六级，实验室和动物攻毒模型上的验证都做完了，他们正和家禽业的合作伙伴一起往下推，看能不能在更大范围里用起来。
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