《ACS Nano》西南医大蔡蕊/赵丹/陶刚团：活性氧响应水凝胶改善骨缺损局部免疫微环境！

前言

糖尿病（DM）是一类以慢性高血糖为特征的代谢性疾病。在糖尿病状态下，由于高血糖引发的氧化应激、慢性炎症以及免疫-成骨级联反应的失调，骨缺损修复过程面临着明显的障碍。

骨髓间充质干细胞（BMSCs）的线粒体稳态在维持能量代谢和骨再生平衡中起着核心作用。因此，通过调节免疫微环境来恢复BMSCs的线粒体稳态和成骨潜力，是实现糖尿病骨缺损修复的有效干预策略。

近期，西南医科大学蔡蕊、赵丹及陶刚团队合作在国际顶级学术期刊《ACS Nano》上发表了最新研究成果。该工作受传统建筑结构“草筋泥”的启发，构建了一种负载多酚类纳米颗粒的活性氧（ROS）响应性复合水凝胶（EM@mSF-AP）。在糖尿病大鼠模型中，该水凝胶有效改善了骨缺损局部的免疫微环境，促进了血管生成，并加速了新骨的形成。

背景介绍

糖尿病对骨组织的影响是复杂多面的，主要涉及氧化应激、免疫失调以及血管生成和骨再生功能的受损。巨噬细胞在免疫-成骨级联反应中起着关键调节作用，主要负责介导炎症期向组织修复期的平稳过渡。然而，长期的血糖异常会加剧巨噬细胞内的氧化应激并导致其极化状态失衡。

这种由巨噬细胞介导的微环境功能障碍，会通过旁分泌信号进一步损害BMSCs的线粒体稳态，抑制其抗氧化防御系统和正常的能量代谢过程，最终削弱其成骨分化潜力，阻碍骨的再生。

现有的骨修复材料在应对上述复杂病理挑战时，往往缺乏对微环境的特异性响应能力，且机械性能难以与骨愈合的长时间动态过程相匹配。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和二甲双胍（Met）已被证实具有良好的清除自由基和调节线粒体功能的作用，但单独应用面临体内半衰期短的问题。因此，开发一种兼具微环境响应性、机械稳定性与多靶点生物活性的递送系统对糖尿病骨缺损修复具有重要意义。

创新点

1.基于“草筋泥”仿生结构强化水凝胶的机械力学性能。研究引入了表面矿化掺锶羟基磷灰石的丝素蛋白短纤维（mSF）作为增强相（模拟“草”的支撑作用），与苯硼酸修饰的海藻酸盐及聚乙烯醇交联形成的水凝胶基质（模拟“泥”的填充作用）相结合。该结构利用纤维的物理缠结，不仅提升了水凝胶的抗压性能，还赋予了材料更稳定的药物缓释能力。

2.靶向微环境的ROS智能响应释放机制。水凝胶基质基于动态硼酸酯键交联形成。在糖尿病骨缺损处特有的高ROS微环境中，硼酸酯键会发生响应性断裂，促使水凝胶内部负载的EGCG-Met纳米颗粒（EM NPs）得以释放，实现了针对病理环境的按需给药。

3. “免疫调节-线粒体稳态”的级联修复通路。材料释放的EM NPs通过清除巨噬细胞内的过量ROS，促使其向促修复的M2型极化。这一过程启动了良性的免疫-成骨级联调节：通过上调BMSCs中Sod2-Cat轴的表达增强内源性抗氧化能力，恢复线粒体膜电位，并上调ATP合成关键酶COX IV，从而系统性地重建了BMSCs的能量代谢与成骨功能。

研究结果

图1与图2：EM NPs及复合水凝胶的合成与理化特性表征。研究人员通过分子自组装技术合成了粒径均匀（平均直径约348 nm）、具有较高负表面电位的EM NPs。傅里叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）等测试证实了EGCG与二甲双胍通过席夫碱反应成功发生结合。这一结果证明实验成功制备了具有稳定分散性和清除自由基潜力的纳米载体，为后续构建响应性体系奠定了基础。

图3：仿生水凝胶的机械抗压性能与病理微环境响应特性。在水凝胶基质中掺入矿化丝素蛋白短纤维（mSF）后，压缩抗阻测试显示其物理承压能力获得提升。体外药物释放曲线表明，复合水凝胶在含有过氧化氢的模拟病理介质中，其降解速度和EM NPs释放量均明显高于中性环境。这证明了引入“草筋泥”的仿生结构设计，既满足了骨缺损填充所需的物理支撑强度，又赋予了材料针对氧化应激环境进行化学响应释放的特性。

图4至图6：体外巨噬细胞抗氧化保护与极化表型调节。通过DCFH-DA与MitoSox探针荧光成像发现，该水凝胶能明显降低氧化应激条件下巨噬细胞内的总ROS和线粒体ROS水平，并通过JC-1探针证实其有助于恢复线粒体膜电位。流式细胞术与免疫荧光分析显示，处理后的巨噬细胞中促炎M1型标志物（iNOS、CD86）表达下降，而促修复M2型标志物（CD206）表达上升。该结果推导得出：水凝胶释放的活性多酚成分能有效缓解巨噬细胞的氧化损伤，并成功诱导免疫细胞向有利于组织再生的M2表型转化。

图7至图10：BMSCs的转录组学分析及线粒体能量代谢恢复。将极化调节后的巨噬细胞与BMSCs进行共培养。对BMSCs的RNA测序（RNA-seq）分析表明，氧化磷酸化、抗氧化防御及TCA循环等通路发生了显著富集。蛋白与生化检测进一步证实，BMSCs中Sod2、Cat以及COX IV等关键酶的表达上升，ATP产率恢复；相应的成骨标志物（Runx2、OPN、ALP）水平及钙结节沉积量均有增加。该部分实验证明，经材料干预的巨噬细胞通过旁分泌途径，系统性修复了BMSCs受损的线粒体能量代谢和抗氧化防御网络，从而有效提升了干细胞的成骨分化潜能。

图11至图13：活体糖尿病大鼠颅骨缺损修复的疗效评估。在糖尿病大鼠颅骨缺损模型中，经过4周和10周的观察，微CT（Micro-CT）定量扫描显示，植入EM@mSF-AP复合水凝胶的缺损区域内新骨体积（BV/TV）和骨密度（BMD）均显著增加。H&E和Masson染色确认了组织形态的重建与胶原纤维的成熟。局部组织切片的免疫荧光染色结果表明，材料在活体内有效促进了巨噬细胞M2极化、促进了血管新生（CD31阳性），并上调了BMSCs线粒体功能蛋白（COX IV）和成骨相关蛋白的表达。这些在体数据直观地验证了该水凝胶材料能够在体内高糖环境中有效调节局部免疫微环境，促进血管化成骨并加速缺损骨的愈合过程。

机理阐释

EM@mSF-AP复合水凝胶促进骨再生的疗效，依赖于材料化学解离与细胞级联信号传递的协同作用机制。

首先，在材料层面，该系统利用了糖尿病组织微环境中固有的异常高水平ROS作为药物释放的触发开关。病灶处高浓度的H2O2与水凝胶交联网络中的动态硼酸酯键发生反应，导致B-C键发生氧化断裂，使致密的水凝胶网络产生降解。这一原位响应解离过程使得封装的EM NPs以及富含Sr2+和Ca2+的mSF降解产物得以定点释放 。

其次，在免疫调节层面，释放的EM NPs利用EGCG分子中多酚羟基的高还原性，发挥直接的中和作用以清除过量的ROS。氧化应激的减轻保护了巨噬细胞的线粒体功能，驱动其细胞表型由分泌促炎因子的M1型转变为分泌促修复因子的M2型 。

最后，在细胞通讯与代谢层面，巨噬细胞表型的转变启动了免疫细胞与成骨细胞间的旁分泌信号级联。该信号作用于周围的BMSCs，激活了其内部的Sod2-Cat抗氧化轴，缓解了高糖环境对线粒体呼吸链的抑制。线粒体膜电位的恢复与COX IV酶表达的上调，使得细胞ATP合成重新活跃。在获得充足能量代谢支持的基础上，结合mSF释放的Sr2+/Ca2+所提供的直接成骨和血管生成刺激，BMSCs的成骨分化程序被全面激活，进而推动缺损骨组织的高效修复。

全文小结

1.该工作提出了一种受“草筋泥”建筑结构启发的矿化丝素短纤维增强复合水凝胶（EM@mSF-AP），解决了常规环境响应性水凝胶在骨修复应用中物理机械支撑强度不足，以及糖尿病微环境中由于持续氧化应激导致的骨修复停滞等问题。

2.研究证明，该水凝胶作用机理在于利用硼酸酯键在ROS环境下的断裂实现按需释放活性纳米颗粒。释放的药物通过清除自由基促使局部巨噬细胞发生M2极化，并借由免疫-成骨级联通讯机制，激活BMSCs的Sod2-Cat抗氧化轴和COX IV蛋白表达，从而重塑了成骨干细胞的线粒体稳态与能量代谢网络。

3.该研究的意义在于，其将材料物理结构的仿生设计与细胞代谢通路的微观重编程相结合。该技术平台不仅能够有效地促进糖尿病相关的骨再生修复，也为未来设计基于免疫微环境调节和细胞器稳态恢复的先进生物材料干预策略提供了客观、科学的参考思路。

参考文献：DOI：10.1021/acsnano.6c02616