Hans Clevers教授讲述开发首个类器官背后的故事：放下预设、用心观察、大胆求证

翻译丨王聪

编辑丨王多鱼

排版丨水成文

2009年，Hans Clevers等人使用来自小鼠肠道的成体干细胞培育出首个肠道类器官，开创了类器官研究时代。

2026 年 5 月 7 日，Hans Clevers 在Cell Stem Cell期刊发表了题为：How ever-expanding organoids from epithelial stem cells were developed: A hypothesis-free approach 的文章，讲述了开发首个类器官的背后的故事。

我的实验室最初并不是为了研究肠道而设立的。我们始于免疫学，尝试理解 T 细胞发育的转录调控。那项工作引领我们定义了 Tcf 转录因子家族，并最终认识到它们是 Wnt 信号通路的核效应物。一个决定性的转折点出现在 Tcf4 基因敲除小鼠展示出显著表型时。它们未能建立肠道干细胞的区域——利贝昆隐窝（crypts of Lieberkuhn）。在深入研读肠道生物学后，我们了解到这些隐窝完成了一项相当不可思议的壮举：它们在生命的每一周都会替换掉整个肠道内壁的上皮层，这是哺乳动物任何实体组织中最快的自我更新过程。我们被这背后的生物学所吸引，并成功地将自己从一个免疫学实验室转变为一个肠道研究实验室。

我们当时的信念是，Wnt 通路（特别是其在肠道中的靶基因）可以提供工具来识别这些神秘的干细胞。生理性的 Wnt 信号驱动着肠道干细胞，而我们也曾在与Bert Vogelstein的合作中发现，该信号通路的突变激活会导致癌症。这听起来像是同一枚硬币的两面。如果我们能定义人类结肠癌中的 Wnt 靶基因程序，这可能启发一种识别健康肠道干细胞的实验方法。

我实验室的一名成员，Marc van de Wetering，构建了可以诱导阻断 Wnt 通路的结肠癌细胞系。理论上，这将允许他通过比较诱导前后转录组来获得一个 Wnt 靶基因列表。然而，在九十年代末，小鼠或人类的基因组序列尚未被破译。流行的方法（例如差异显示）在我们手中没有奏效。大约在 2000 年，斯坦福大学的 Pat Brown 发明的基因微阵列技术成为了救星。一位荷兰合作者 Cor Verweij 当时恰好在 Pat Brown 的实验室进行学术休假，设法搞到了两块微阵列芯片。Cor Verweij询问在 Marc van de Wetering 的结直肠癌细胞系中抑制 Wnt 后哪些基因表达下调。在阻断 Wnt 通路后的两个时间点分离 mRNA，从未诱导样本制备的 cDNA 和诱导后的 cDNA 样本用不同颜色标记，混合后与一个包含大约 24000 个 cDNA 条目的 DNA 微阵列杂交。一个肠道内 Wnt 基因的候选名单由此诞生。

与此同时，我所在的医院在各部门和董事会之间增加了一层额外的官僚机构。作为部门负责人，我发现自己陷入了一个不断扩张的卡夫卡式的管理者世界。2002 年，我辞去职务，并将整个实验室搬到了街对面的 Hubrecht 研究所，这是一个拥有百年历史的胚胎学研究所，以 Pieter Nieuwkoop（发育生物学奠基人之一）在青蛙发育方面的工作而闻名于世。这被证明是一个绝佳的举措。

在 Hubrecht 研究所的新大楼安顿下来后，我们孜孜不倦地研究这个候选基因列表，仔细查看表达模式，并为有希望的候选基因创建转基因小鼠模型。这最终引导了英国博士后 Nick Barker 鉴定出Lgr5是隐窝基底微小细胞的标志物，这些细胞规则地散布在体积大得多的潘氏细胞之间。Nick Barker 实验的关键是培育了一种基因敲入小鼠，它从 Lgr5 位点共表达绿色荧光蛋白（GFP）和他莫昔芬诱导版本的 Cre 重组酶。GFP 使得这些微小细胞能被观察到，而通过 Cre 酶进行的谱系追踪则为它们的长时期干性提供了确凿证据。Lgr5+ 干细胞后来被证明有很多令人惊讶的特性。当时，人们普遍认为干细胞很少分裂。然而，Lgr5+ 细胞却持续不断地进行细胞周期，细胞分裂时间不到一天。这一观察激发了几次尝试，试图在器官芯片形式中培养上皮碎片和分离的隐窝。这些努力都失败了。实验室成员并不感到意外，因为当时普遍认为正常细胞无法在培养中长期存活，更不用说增殖了。当时认为，只有癌细胞才能做到。

在此期间，Marc van de Wetering 学会了如何从 Nick Barker 的小鼠模型中流式分选出脆弱的 Lgr5-GFP+ 细胞。来自日本的 Toshiro Sato 随后以博士后身份加入我的实验室。Toshiro Sato 在东京攻读博士学位期间曾尝试在 2D 培养中培养隐窝，他是实验室里唯一一个想再试一次的人。我们接下来制定了一个计划。目标是从几个分选出的干细胞开始，使用确定的生长因子来扩增它们的数量。我听到 Wnt 领域的开创者 Roel Nusse 在一次报告中提到，他实验室的博士后 Arial Zheng 试图在培养中扩增小鼠乳腺上皮细胞。Roel Nusse 强调，将 Wnt 激活与酪氨酸激酶受体（例如 EGFR 或 HER2）的激活结合起来是关键。

上皮生长因子（EGF）早在 20 世纪 80 年代就已被确认为隐窝的促有丝分裂因子，并且可以商业化获取。激活 Wnt 则更为复杂。Roel Nusse 已经证明，分泌型的 Wnt 蛋白经过脂质修饰，这使它们溶解度低且难以生产。稳定转染 Wnt3A 的细胞培养上清液可以适度激活 Wnt 信号，但必须以 1:1 的比例与新鲜培养基混合使用，而且它含有 10% 的血清。血清后来被证明对隐窝细胞是致命的。在寻找激活 Wnt 通路替代方法的过程中，我们转向了 Rspondin 蛋白。Niers 和 Wu 在非洲爪蟾筛选中将其中一种 Rspondin 鉴定为 Wnt 信号的放大器。与此同时，日本酿酒公司麒麟（Kirin）一直在资助一家位于美国加州的生物技术公司 Nuvelo，进行转基因小鼠筛选，以发现分泌蛋白的新功能。他们的蛋白之一，Rspondin1，产生了一种肠道上皮细胞高度增生的小鼠。为了开发 Rspondin1 用于再生目的，Nuvelo 已启动一期临床试验。当我们与他们的一位科学家 Ari Abo 交谈时，发现 Nuvelo 即将关闭。Ari Abo 与我们分享了大量剩余的临床级 Rspondin1。尽管当时 Rspondin 的作用机制尚未阐明，但决定使用 Rspondin 而非 Wnt 条件培养基被证明是幸运之举。

在 Nick Barker 鉴定肠道干细胞的项目之外，我们一直在转基因小鼠中操纵信号通路，以确定允许隐窝微环境支持其持续自我更新的生长因子环境。我们相当随机地关注了包括 Notch 和 BMP 在内的通路。虽然 Notch 通路产生了显著的表型，但这些似乎与干细胞下游的命运决定有关。探究 BMP 通路的灵感来源于 Brigid Hogan 在探讨 BMP 信号在皮肤毛囊模式形成中的作用时，使用了转基因 Noggin 等位基因。Noggin 是一种 BMP 因子的分泌型抑制剂。Ana Haramis 构建了一种在肠道上皮中表达 Noggin 的转基因小鼠。这些小鼠表现出强烈但非常奇特的表现：我们注意到沿着绒毛长度出现了许多小型隐窝。这些迷你隐窝又产生了它们自己的微小绒毛，形成了令人困惑的迷宫样结构。我们得出结论，BMP 的抑制创造了一个“允许隐窝形成”的环境（当时暂时没有更好的描述）。随后，我们的病理学家 Johan Offerhaus 指出，这些病变与在患有幼年性息肉病（一种由 BMP 通路成分功能丧失突变引起的遗传综合征）的儿童身上看到的病变极为相似。Noggin 显然是需要添加到 Toshiro Sato 的培养基组合中的一个候选因子。我们努力尝试了包含三种因子的组合：EGF、Rspondin 和 Noggin。然而，还是没有生长。

我在一次研讨会的茶歇中遇到了 Mina Bissell，并向她征求对 Toshiro Sato 项目的建议。她简单地回答：Matrigel（基质胶）。基质胶是一种神奇但成分不明确的细胞外基质样提取物，它是从在小鼠腹腔中生长的 EHS 肉瘤细胞中纯化出来的。

确实，当 Toshiro Sato 将他的干细胞嵌入一小滴基质胶中，在 37°C 下使其形成水凝胶，然后在无血清条件下加入三因子组合时，他观察到了从原代隐窝（后来甚至是单个Lgr5+ 干细胞）开始的惊人扩增。但并非预期的干细胞团，而是出现了独特的结构：封闭的上皮囊性结构，带有出芽。显微镜观察显示，这些芽重现了隐窝的关键特征，在基部有干细胞和潘氏细胞。中央的管腔包含了其他主要细胞类型：杯状细胞、肠上皮细胞和产生激素的肠内分泌细胞，它们都完全分化，并且其基底侧位于 Toshiro Sato 后来所称的“迷你肠道”的外侧。这些结构可以无限期地扩增，没有表现出预期的端粒缩短、衰老、增殖耗竭或恶性转化。事实上，来自单个 Lgr5+ 干细胞的类器官后代可以被移植到多只小鼠体内，产生持续存在的健康上皮斑块。

偶然获得了大量的 Rspondin1，被证明是多方面的福音。首先，高浓度的 Rspondin 在类器官培养中是必需的。如果不是 Nuvelo 捐赠了他们的临床批次，我们很可能永远无法添加所需的量。其次，我们在很久以后才发现 Lgr5 是 Rspondin 的受体；其作用机制现在已得到充分理解。第三，小鼠潘氏细胞产生 Wnt3 并在其周围形成一个陡峭的 Wnt 信号梯度。添加的 Rspondin1 会放大 Wnt 信号强度，但保持这种局部梯度，这就是为什么小鼠小肠类器官始终包含紧邻其 Wnt 源（潘氏细胞）的活跃分裂的干细胞。在更远端，Wnt 信号较弱，允许祖细胞分化为其他任何细胞类型。如果我们当时用人肠隐窝（其中潘氏细胞不产生 Wnt）做实验，就不得不结合使用 Wnt3A 和 Rspondin。那样将不会出现对称性破缺的 Wnt 梯度，而是普遍存在的强 Wnt 信号：我们可能会得到一团没有任何有趣特征的祖细胞球，然后我们很可能就转向下一个项目了。

自从这些关于上皮类器官培养的最初实验以来，人们学到了很多。培养不一定必须从纯化的干细胞开始；小的组织碎片通常就足够了。甚至可以从尿液（膀胱或肾脏）或痰液（气道）中培养出类器官。经过优化生长因子组合（即使不是全部），大多数上皮类型都可以被培养。这些组合无一例外地做三件事：它们强烈激活 Wnt，激活组织相关的酪氨酸激酶受体（例如 EGF、FGF 和 HGF），并抑制 BMP/TGF-β 信号。通常还需要额外的生长因子或激素。而基质胶仍然是提供必要细胞外基质信号的神奇成分。

自 Toshiro Sato 在 2009 年首次描述基于组织干细胞的类器官培养以来，实验室一直在追求广泛应用的原理验证，并已扩展到许多其他器官类型的生物学现象和疾病研究。在此期间，我曾担任荷兰皇家科学院院长数年，这是一个媒体曝光度很高的角色。随后，我共同创立了荷兰首家专门治疗儿童癌症的医院，一个非常特别的地方，叫做玛克西玛公主中心（Princess Maxima Center）。在过去的 7 年里，我一直在瑞士一家跨国制药公司罗氏制药担任董事会成员。这是三个截然不同但都令人着迷的角色。

自从大约 50 年前我第一次踏入实验室以来，实验室的工作台一直是我日常的锚点。一路走来，我学到了很多东西，但有一点尤为突出：不要试图智胜大自然（don’t try to outwit Nature）。在研究一个生物学问题时，不要通过提出一个假设来让自己带有偏见。你总会是错的。大自然终将揭示她的秘密，但前提是你要保持作为一个思想开放的观察者，并有勇气遵循大自然的指引，即使这会让你感到不适。

https://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(26)00141-4