玉米黄曲霉毒素测量法

黄曲霉毒素，英文缩写AFT，是二呋喃环和香豆素（氧杂萘邻酮）组成的化合物，由黄曲霉、寄生曲霉等菌株产生，分子量为312～346，熔点为200～300℃，具有稳定、耐高温特性，可于长波紫外光下产生荧光，根据荧光颜色、RF值及结构不同等分为B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、R1、GM、毒醇。

AFT难溶于水、乙烷、乙醚和石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯仿、乙腈和二甲基甲酰胺等有机溶剂。AFT可在PH1～3的酸性溶剂中稍分解，PH9～10溶液中迅速分解破坏，遇碱可迅速分解，在PH9～10碱性溶液中可分解为几乎无毒的盐，可在酸性条件下还原。

实验目的

黄曲霉素是泛指一些由真菌产生的强毒性致癌类物质，短期摄入高剂量（1㎎/kg体重）可导致急性中毒，常见发热、呕吐、黄疸等肝功能异常症状或肝坏死，长期低剂量（20微克/千克体重）暴露会显著增加肝癌、胃癌等患病风险，因其广泛存在于农作物与食物中，并对人体和动物危害巨大，故而建立快速、准确的检测方法对保障食品安全与公共健康具有重要意义。

本实验旨在通过固相酶联免疫吸附ELISA的原理，即酶联免疫法，限量、定量测定样品中黄曲霉毒素B1的含量，为食品污染风险评估提供科学依据。

实验仪器

①ST-2000A 霉菌毒素测定仪

②玉米、均质器、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）、微量移液器、甲醇、正己烷、三氯甲烷或二氯甲烷试剂

实验步骤

①检查实验所用器材，确保其干净干燥无污染

②甲醇、去离子水以7：3比例配取样品提取液

③取粉碎玉米样品2g，放于50ml离心管，加5ml样品提取液，振荡5分钟，室温4000转/分离心10分钟，结束后取0.5ml上清，加入0.5ml去离子水，混匀

④将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min，摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，并用去离子水将20×浓缩洗涤液按20倍稀释成工作洗涤液。

⑤将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶标记物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗体工作液，用盖板膜封板，轻轻振荡5秒混匀，25℃反应30分钟。

⑥揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用工作洗涤液250µl/孔充分洗涤5次，每次间隔30秒，用吸水纸拍干

⑦每孔加入底物液A（50µl），再加底物液B（50µl），振荡5秒混匀，25℃避光显色15分钟。

⑧每孔加入终止液50µl，轻轻振荡混匀，终止反应。

⑨用黄曲霉素测定仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成

⑩仪器完成测定，自动给出结果

实验结果

经检测，该样品的黄曲霉毒素约为0.19ug/kg，满足GB 2761-2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》标准。