细数酶介导的药物-药物相互作用（DDI）

当一种或多种具有“加害作用（perpetrator）”的药物改变同时服用的“受害者药物（victim）”的全身暴露量时，即发生药物相互作用（DDIs）。DDIs可通过PK、PD或药剂学机制发生。药物代谢酶（DMEs）功能改变是导致药代动力学DDIs重要因素之一。

PK DDI会导致受影响药物的Cmax、AUC和/或Tmax发生改变，并可能引发严重不良事件，因此药物研发中DDI风险评估至关重要。为降低临床不良事件风险，监管机构要求开展临床前DDI风险研究，需明确DDI发生潜力、作用机制，并收集PK参数以预测临床影响。

对于“受害者药物”，需明确其消除途径，以及参与代谢清除的每种酶的作用，可通过临床前消除研究和体外评估（如反应表型分析）实现。对于“加害者药物”，则需明确其改变受影响药物代谢相关酶活性的机制（如可逆性抑制、不可逆性抑制或酶表达诱导），同时收集描述抑制或诱导速率的动力学参数，以关联临床暴露量并预测人体中的DDI。

本文旨在帮助理解酶介导的DDIs，涵盖临床前和临床研究及预测的最新方法，重点关注小分子药物及高影响药物代谢酶（细胞色素P450酶CYP和尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶UGT）。

体外反应表型分析与代谢分数预测方法整理

本部分聚焦体外反应表型分析（明确“受害者药物”代谢关键酶）与代谢分数（fm）预测，详细阐述其核心意义、传统及新型研究方法、关键注意事项，以及不同药物类型（CYP底物、UGT底物、慢代谢化合物）的适配策略。

定量预测合并用药对“受害者药物” PK的影响，需完成三项关键任务：明确参与“受害者药物”代谢的特定酶、估算特定途径对总清除率的贡献比例、确定相关酶代谢药物的分数（fm）。

反应表型分析指识别“受害者药物”代谢关键酶的过程，也就是通常所说的代谢酶表型分析。这点容易理解，先搞清楚药物是被哪些酶代谢的，就能评估影响该代谢酶，可能会对该药物造成什么样的影响。比如，代谢酶被诱导，则可能导致“受害者药物”的暴露量下降。

明确一些关键参数的定义。总清除率分数（fCL）指单个清除途径（如代谢清除、肾脏清除）对总清除率（CLtot）的贡献比例，取值0-1，所有途径比例之和为1。代谢分数（fm）指单个酶对代谢清除率的贡献比例，取值同样0-1，仅计入代谢清除的贡献。例如，若药物经多酶代谢且存在肾脏清除，总清除率可表示为“fCL,renal+fCL,metabolism×(fm,enzyme,1+fm,enzyme,2+…+fm,enzyme,n)”。

传统体外研究方法

1.重组酶系统法（适用于CYP底物）

利用重组CYP450酶，结合相对活性因子（RAF）或系统间外推因子（ISEF），建立重组酶与人类肝脏微粒体（HLM）的缩放因子，进而计算fm。两种因子之间有一定差异。ISEF需考虑HLM中CYP的丰度。RAF需用半数最大活性浓度（Km）校正未结合分数（Km,u）。两种因子理论上可用于任何代谢酶，但需重组酶系统活性稳定，且至少有1种特异性探针底物用于建立RAF或ISEF。局限性体现在不同探针底物对应的RAF或ISEF可能存在差异；同一探针底物若通过“产物生成”或“母体（原型化合物）消耗”监测酶活性，ISEF值可能相差2倍以上；一种底物生成的RAF/ISEF值可能不适用于另一种底物，难以提前判断与研究药物最匹配的探针底物。

那么如何计算fm呢？首先选择无其他酶污染，活性稳定、表达单一非人CYP亚型的重组酶（如CYP3A4、CYP2D6）。HLM则使用混合供体HLM（覆盖人群多样性），且需验证其总代谢活性（如通过已知底物的清除率确认）。其次是探针底物的选择，所谓探针底物，其实就是公认的可以被特定CYP450酶特异性代谢的阳性化合物，要选择对目标CYP亚型“特异性高”“代谢途径明确”的探针（如CYP3A4用咪达唑仑，CYP2D6用右美沙芬）。探针需同时在重组酶和HLM中稳定代谢，且代谢产物易检测（如通过LC-MS/MS定量）。然后是缩放因子RAF或ISEF，缩放因子的核心是“量化重组酶与HLM中同一CYP亚型的活性差异”，RAF和ISEF的计算逻辑不同，但均需通过探针底物实验实现。

RAF的计算基于“探针底物的Km校正”，反映重组酶与HLM中CYP的比活性（单位酶量的活性）比值，简要步骤如下：1）分别测定探针底物在“重组酶”和“HLM”中的酶动力学参数：需设置多组探针底物浓度（覆盖0.5-5倍Km范围），测定代谢产物生成速率，拟合米氏方程，得到Km（半数最大活性浓度）和Vmax（最大反应速率）；2）同时测定“未结合分数（fu）”，即游离药物的占比，将Km校正为未结合Km（Km,u=Km×fu），消除蛋白结合对底物浓度的影响；3）按公式计算RAF：RAF=(Vmax重组酶/Km,u重组酶)/(VmaxHLM/Km,uHLM)，分子是重组酶中目标CYP对探针的“比活性”（Vmax/Km,u，反映单位酶量的催化效率）。分母则代表HLM中目标CYP对探针的“比活性”（因HLM含多种CYP，需确保探针仅被目标CYP代谢）。

ISEF的计算则是基于“CYP丰度”校正，需额外测定HLM中目标CYP的蛋白丰度。大致步骤如下：1）先完成与RAF相同的步骤：测定探针底物在重组酶和HLM中的Vmax（无需校正Km）；2）测定HLM中目标CYP的蛋白丰度（Abundance，单位：pmol/mgHLM蛋白）：常用方法为LC-MS/MS靶向定量（检测CYP特异性肽段）或免疫印迹法；3）按公式计算ISEF：ISEF=(Vmax重组酶/[E]重组酶)/(VmaxHLM/AbundanceHLM)。其中，[E]重组酶代表重组酶中目标CYP的浓度（已知，如10pmol/mL反应体系）。分子代表重组酶中目标CYP的“比活性”（Vmax/[E]，反映单位浓度酶的催化效率）。分母代表HLM中目标CYP的“比活性”（VmaxHLM除以HLM中该CYP的丰度）。

前面几个步骤都是用探针底物在对实验体系的参数进行标定。最后就是利用标定好的这些参数计算目标药物的fm。fm是“单一CYP对目标药物总代谢的贡献占比”，需先测定目标药物在重组酶和HLM中的内在清除率，再结合缩放因子推导。重组酶中的CLint（CLint,重组酶）和HLM中的总代谢CLint（CLint,HLM总）用目标药物孵育重组酶或HLM，测定代谢产物生成速率（或母药消耗速率），按“CLint=反应速率/药物浓度”计算。其中，CLint,重组酶需要用前面获得RAF或ISEF进行校正，将重组酶中单一CYP的CLint校正为“该CYP在HLM中的CLint”：CLint,HLM单一CYP=CLint,重组酶×缩放因子（RAF或ISEF）。缩放因子已量化重组酶与HLM的活性差异，校正后可反映HLM中该CYP对目标药物的实际代谢能力。

若目标药物仅被N种CYP代谢，总代谢CLint为各CYPCLint之和：

CLint,HLM总=CLint,HLMCYP1+CLint,HLMCYP2+...+CLint,HLMCYPN

单一CYP的fm为：fm,CYPx=CLint,HLMCYPx/CLint,HLM总

例如：若CYP3A4的CLint占HLM总CLint的60%，则fm,CYP3A4=0.6。

2.化学/单克隆抗体抑制法

在人类HLM或肝细胞等体外系统中，使用选择性抑制剂，通过“母体消耗减少”或“特定代谢物生成减少”估算fm，是反应表型分析的补充方法。两种检测方式对比：1）母体消耗法：无需代谢物标准品，通过抑制剂存在时母体消耗速率下降估算fm；2）代谢物生成法：需代谢物标准品，通过抑制剂存在时特定代谢物生成速率下降估算fm。

特定药物类型的适配方法

1.UGT底物（尿苷5'-二磷酸葡萄糖醛酸转移酶底物）

根据ICH DDI指南，需结合多种方法，因UGT1A3、UGT1A6、UGT2B7、UGT2B15缺乏相对选择性抑制剂。常用方法：使用重组UGT亚型、表达UGT亚型多态性变体的HLM、RAF或相对表达因子（REF）法、活性关联法。

2.慢代谢化合物

在微粒体和肝细胞中周转率低，难以直接测定fm。可以考虑采用肝细胞接力法、共培养系统（如HepatoPac、HμREL®、3D球体），延长孵育时间（4-7天，传统方法仅90-120分钟），并每日补充抑制剂以监测慢清除过程。

关键注意事项：1）抑制剂选择需适配长期孵育，例如雷洛昔芬可在HLM短期孵育中抑制CYP3A，但因自身会被UGT代谢，无法用于肝细胞长期孵育；2）需确保抑制剂在孵育期间维持80%-90%（理想为100%）的酶活性抑制，避免因抑制剂消耗、批次差异、酶水平变化影响结果；3）贴壁肝细胞与长期共培养系统的fm估算结果可能存在差异，需优化实验条件以保证HepatoPac等系统结果的可靠性。

酶抑制及其机制研究

本部分阐述CYP酶抑制机制的体外研究方法，核心分为可逆抑制与不可逆抑制两大模块，分别涵盖其作用机制、数据分析方法、DDI预测模型及关键注意事项等。

可逆抑制（Reversible Inhibition）

可逆抑制的核心特征是作用短暂，DDI强度与抑制剂和受影响药物的同时暴露浓度相关，关键参数为半数抑制浓度（IC50）和抑制常数（Ki）。

1.数据分析方法

IC50通过“探针底物+多浓度抑制剂”实验测定，反映抑制剂的抑制能力；抑制剂指的就是拟评估的候选分子。

Ki可通过Cheng-Prus off方程由IC50估算，竞争性抑制时Ki= IC50/2，非竞争性抑制（底物浓度=Km时）Ki= IC50；

研究显示，92%化合物通过IC50/2估算的Ki与实验测定值偏差在2倍以内，该方法可作为初始合理选择。

实验设计要求：需覆盖0.5-5倍预期Ki（抑制剂）和Km（底物）的浓度范围，常用人类HLM或肝细胞系统。

数据拟合方法：1）线性化法：通过Lineweaver-Burk图（y轴1/反应速率，x轴1/底物浓度）或Dixon图（y轴1/反应速率，x轴抑制剂浓度），肉眼观察判断抑制类型；2）非线性回归法：将速率方程拟合到体外数据，通过统计学比较不同模型的拟合度确定抑制类型。

不可逆抑制（Irreversible Inhibition）

不可逆抑制以时间依赖性抑制（TDI）为特征，需与酶预孵育且抑制作用随时间增强，核心机制为活性代谢物导致酶永久失活，关键参数为半数失活浓度（KI）和最大失活速率（kinact）。

1.作用机制分类

TDI的常见机制包括慢紧密结合、亲和标记、生成强效可逆抑制代谢物、机制性失活（MBI）。不可逆抑制会耗尽活性CYP酶，需新合成酶才能恢复代谢能力，临床影响通常强于可逆抑制。

2.数据分析方法

核心参数定义：1）KI：半数失活浓度（注意与可逆抑制的Ki区分）；2）kinact：最大失活速率；3）kinact/KI：二级速率常数（共价效率常数），反映酶与抑制剂的亲和力及共价结合速率。

筛选与测定方法：

IC50位移实验（初筛）：比较“有无预孵育”的IC50，若预孵育后抑制活性增强（IC50降低），提示潜在TDI；需加入≥10倍稀释步骤、使用>4倍Km的底物浓度，避免可逆代谢物干扰，IC50倍移>1.5时需进一步验证。

kobs实验（初筛）：在1-2个抑制剂浓度下，监测随时间的剩余酶活性，计算一级速率常数kobs；溶剂校正后kobs>0.01min⁻¹时，与体内DDI数据一致性较好。

重绘图法（传统标准）：将不同抑制剂浓度下的kobs拟合到米氏方程，估算KI和kinact；但需假设稳态动力学、单结合位点、线性失活，且线性数据点选择主观，可能导致参数偏差。

数值分析法（更优选择）：通过联立常微分方程（ODEs）估算KI和kinact，无需上述假设，可根据机制数据或观察到的动力学调整模型；通过Akaike信息准则（AIC）和残差分析选择最佳拟合模型，数据稀疏时需结合机制实验验证。

酶来源差异影响：1）HLM：最常用，数据可靠性较高；2）肝细胞：kinact/KI,u通常低于HLM，导致DDI预测强度偏低（CYP3A失活剂），非CYP3A失活剂趋势相反，原因尚不明确；低渗透性或转运体底物抑制剂需注意浓度分布问题，避免参数估算错误；3）重组酶：成分简单，适合区分不同CYP亚型的失活效率，但kinact通常偏高，且批次差异可能导致MBI检测不稳定。

3.机制验证研究

为明确不可逆抑制的具体机制，需开展后续实验，主要包括三类：1）代谢中间复合物（MIC）检测：MIC为代谢物与血红素铁紧密结合（非共价），可通过455nm吸光度增加直接监测；加入铁氰化钾等解离剂，若酶活性恢复，可间接证实MIC形成（需注意不同功能基团可能需不同解离剂）；2）血红素/脱辅基蛋白修饰检测：血红素修饰通过分光光度法检测一氧化碳结合能力，判断血红素完整性；脱辅基蛋白修饰通过全蛋白质谱分析（观察峰移）、胰蛋白酶/蛋白酶K消化定位加合位点并定量；3）活性代谢物捕获：在缓冲液中加入谷胱甘肽（捕获软亲电体）或氰化钾（捕获硬亲电体），通过高分辨率质谱（HRMS）分析加合物，确定生物活化位点。

代谢物抑制作用注意：I/II相代谢产物可能引发抑制，需根据酶源的代谢能力选择实验系统（如HLM需UDPGA才能生成葡糖醛酸苷，肝细胞可自主生成）。

酶诱导及其机制研究

CYP酶诱导的作用机制

诱导作用会导致受影响药物（“受害者药物”）的全身暴露量降低，核心是“加害者药物”通过核受体调控CYP酶的基因转录与表达，具体过程与受体类型如下：

1.核心作用路径

“加害者药物”与胞质中的核受体结合（如芳香烃受体AHR、孕烷X受体PXR、组成型雄甾烷受体CAR）；结合后的核受体转移至细胞核，与辅助受体形成异二聚体（AHR结合ARNT，PXR/CAR结合RXR）；异二聚体结合DNA特定元件，启动下游基因转录，最终增加目标CYP酶的mRNA水平与蛋白表达。

2.各受体调控的CYP酶类型

PXR：主要诱导CYP3A4，同时也可诱导CYP2C家族（如CYP2C8/9/19）；

CAR：对CYP3A4有一定诱导作用，研究更集中于CYP2B6的诱导；

AHR：主要诱导CYP1家族，以CYP1A2为主。

3.物种差异与临床重点

核受体的配体结合位点在物种间差异显著，动物模型的诱导潜力无法代表人类，因此需依赖人类来源的体外系统；

临床中CYP3A4诱导影响最突出（因该酶参与大量药物代谢），若体外观察到CYP3A诱导，需按FDA指南进一步评估CYP2C家族；CYP2B6、CYP2C8等酶的诱导证据逐渐增多，但体外cut-off标准（用于判断临床相关性）仍在完善中。

体外诱导潜力评估工具

常用工具涵盖从受体水平到细胞水平的多种系统，各有优劣，需根据研究阶段与需求选择：

3D培养的优势：1）3D肝细胞球的诱导能力强于2D单层培养，可识别2D系统漏检的临床诱导剂（如AZD1208）；2）2D培养中YAP/TEAD信号通路过度激活，可能导致非生理性CYP诱导（假阳性），3D培养可显著减少此类干扰；3）3D系统可同时捕获核受体介导的直接诱导与间接诱导机制，有望成为未来主流筛选工具，但需多实验室验证以标准化。

体外诱导实验的设计考量

实验设计需关注多个细节，以确保结果的准确性与可重复性：

1.检测指标选择

常用指标包括mRNA水平、酶活性，蛋白表达也可检测，但与mRNA预测价值相近；

mRNA检测灵敏度高于蛋白与活性，是更优的早期终点；

若仅检测酶活性，需注意：若研究药物同时抑制/灭活诱导出的CYP酶，可能掩盖实际诱导效果（导致误判）。

2.实验条件控制

阳性对照：必须包含各CYP酶的已知诱导剂（如CYP3A4用利福平），验证系统是否能正常检测诱导；

孵育时间：建议48-72小时，以最大化诱导效应，提升检测灵敏度；

药物浓度：需测试浓度依赖性，最高浓度应至少为“预测稳态未结合血浆浓度”的10倍（溶解度允许前提下）；

药物消耗：需监测孵育过程中诱导剂的浓度变化（可能因代谢导致消耗），可采用“平均浓度”或“给药前Cmin”进行校正。

体外诱导数据的分析方法

核心是通过拟合浓度-效应曲线，计算关键参数（Emax、EC50），需根据曲线类型选择合适的分析策略：

1.核心参数定义

Emax：最大诱导效应（通常以“诱导倍数”表示，即处理组/对照组的比值）；

EC50：达到半数最大诱导效应所需的药物浓度，反映诱导剂的potency。

2.不同曲线类型的分析策略

经典S型曲线（如利福平）：拟合难度低，不同模型计算的EC50/Emax结果差异小；

非典型曲线（钟形曲线、未达Emax的不完整曲线）：需按IQ联盟指南分步分析：

确定实验室诱导实验的固有误差（%CV），作为数据取舍标准；

剔除钟形曲线中“诱导倍数下降超过%CV”的数据点；

用不同模型拟合剩余数据，排除“Emax估算值超出观察值%CV范围”的模型，再通过AICc选择最佳拟合模型。

II相代谢DDI

II相代谢DDI临床报道少的原因：1）UGT（II相酶代表）的代谢分数（fm）通常较低（多<0.5），抑制/诱导对整体清除影响小；2）UGT底物的Km值较高（多为两位数μM级），体外抑制/诱导效应难转化为临床显著DDI；3）II相酶常代谢“一级代谢产物”，而非母药，因此其抑制/诱导不会改变母药浓度。

临床DDI预测的监管指南核心要求

各监管机构（FDA、EMA、PMDA、ICH）均出台指南框架，规范DDI风险评估，核心聚焦CYP酶介导的相互作用，同时覆盖其他代谢酶，关键要求如下：

1.FDA核心推荐（2020年小分子体外药物相互作用指南）

需完成三项核心评估：1）明确研究药物的主要消除途径；2）估算酶和转运体对药物处置的贡献；3）表征药物对酶和转运体的影响（抑制/诱导）。

CYP酶评估重点：优先评估7种核心CYP亚型（CYP1A2、2B6、2C8、2C9、2C19、2D6、3A4），超95% FDA批准药物的代谢依赖这7种酶；若核心CYP不介导主要代谢，需扩展评估其他酶（如CYP2A6、2E1）及I/II相酶（如AO、CES、UGT、GST）。

2.多机构指南共性与差异

共性：均推荐通过体外（酶抑制/诱导实验）、体内预临床、临床研究阶梯式评估DDI潜力；均提供“模型+cut off阈值”用于预测临床DDI（篇幅所限，模型部分本文未展开介绍，后续有机会再专文分享），若预实验提示强DDI风险，需开展专项临床试验。

差异：各机构的模型假设（如安全系数）、阈值标准存在细微不同，需结合目标市场的监管要求调整。

临床研究设计建议：需根据DDI类型（抑制/诱导）、机制及研究人群（健康志愿者/患者）确定方案，同时明确“指标底物/抑制剂/诱导剂”的选择（确保特异性与敏感性）。

体内/临床DDI研究设计的核心考量

临床DDI研究需基于体外预实验结果，聚焦“最坏情况”设计，确保能准确捕捉DDI的存在与强度，关键考量如下：

1.动物模型的局限性与价值

局限性：物种差异导致动物模型预测能力有限，例如HLM中CYP灭活剂在大鼠肝微粒体中可能无活性，大鼠体内实验常无法复现人体DDI。

价值：1）胆汁淤积（BDC）大鼠/犬/猴模型：用于定性评估药物主要消除途径（通过收集胆汁、尿液、粪便，测定胆汁清除、肾清除、吸收分数），支持首次人体（FIH）试验申报；2）泛CYP抑制剂预处理：通过对比“有无抑制剂”的体内清除率，粗略估算CYP介导代谢的总贡献，辅助临床DDI预测。

2.临床研究的核心设计要素

（1）研究目标与终点

目标：明确研究药物是“加害者药物”（介导DDI）还是“受害者药物”（被DDI影响），验证体外预测的DDI风险，为临床用药提供缓解策略。

终点：以“受害者药物的全身暴露变化”为核心，计算PK参数比值（如AUCR=有作用药物时的AUC/单独给药时的AUC，Cmax比值同理）。

（2）研究人群选择

优先选择健康志愿者：适用于大多数药物，可减少患者基础疾病、合并用药的干扰。

患者人群：适用于治疗窗窄的药物（如化疗药），或健康志愿者PK与患者差异大的情况（如肝肾功能不全患者）。

（3）研究设计类型

临床研究主要采用“交叉设计”或“平行设计”，两种设计的对比如下：

（4）给药方案设计（最坏情况原则）

加害者药物（抑制/诱导）：1）采用最高临床剂量、最短给药间隔，重复给药至稳态；2）不可逆抑制剂/诱导剂需给药至“最大抑制/诱导效应”（如酶活性达稳态），而非仅作用药物自身达PK稳态。

受害者药物：1）采用单次低剂量给药，此时代谢改变对PK的影响最显著；2）剂量需结合“暴露变化预期”“治疗窗”“生物分析灵敏度”调整（如低剂量需确保能检测到药物浓度）；

给药间隔：需调整加害者药物与受害者药物的给药时间，确保在“作用位点（如肝脏）产生最大DDI效应”（如酶抑制峰值时给予受害者药物）。

（5）指标药物选择（底物/抑制剂/诱导剂）

指标底物：需满足“80%以上代谢依赖单一酶”“PK线性”“安全窗宽”“半衰期短”，例如CYP3A4用咪达唑仑；需注意部分底物可能同时与转运体作用，导致结果解读复杂。

指标抑制剂：选择“高选择性”“强抑制活性”（使敏感底物暴露增加≥5倍）的药物，避免交叉抑制其他酶；优先选半衰期短的药物（缩短达稳态时间，减少研究周期）。

指标诱导剂：选择特异性核受体激动剂，如利福平（激活PXR/CAR，诱导CYP3A4/2B6）；需注意诱导剂可能同时影响多个代谢途径。

3.复杂DDI场景的应对

部分药物存在“多重DDI机制”或“自身相互作用”，需特殊关注：

多重机制：如某药物既是CYP3A4抑制剂也是诱导剂，需设计动态给药方案（如先观察短期抑制效应，再观察长期诱导效应），避免单一时间点误判。

自身相互作用：如伊马替尼（CYP3A4底物，同时不可逆抑制CYP3A4），重复给药后CYP3A4活性下降，导致CYP2C8介导的代谢占比升高，需同时评估两种酶的DDI风险。

应对策略：需全面鉴定药物代谢相关的所有酶/转运体及其贡献，结合PBPK模型模拟复杂场景，最终通过临床研究验证。

引自：Enzyme-mediated drug-drug interactions: a review of in vivo and in vitro methodologies, regulatory guidance, and translation to the clinic

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