华大新突破！解锁纳米孔测序设备多肽解析新潜能

蛋白质是生命活动的执行者，对其进行快速、准确的微观解析，是生物技术领域面临的重要挑战，而多肽作为蛋白质的重要组成单元，其高效检测与分析更是蛋白研究的核心环节。近年来，基于纳米孔技术的多肽与蛋白质表征被视为最具潜力的下一代蛋白解析方案之一。然而，样品制备难、分子操控复杂、信号解析不易等难题，一直制约着纳米孔技术在多肽检测领域的落地应用。

针对上述技术瓶颈，华大生命科学研究院牵头建设的基因组多维解析技术全国重点实验室提出了一种新的解决方案，成功让现有成熟的纳米孔测序设备直接具备高通量多肽检测的能力。

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具体来说，华大团队从技术底层创新突破，设计出了一套适配现有纳米孔测序芯片的全新解决方案。团队以DNA作为牵引分子，借助解旋酶带动多肽稳定通过纳米孔。同时，为实现多肽与DNA的快速高效偶联，团队采用修饰试剂对天然多肽末端进行叠氮化修饰，构建出“核酸-多肽-核酸”的“三明治”文库结构（OPO 文库）。这一文库制备技术从天然多肽或蛋白质起始，操作简便高效，完美衔接现有纳米孔测序设备，打破了样品制备的瓶颈。

（左）OPO文库制备流程示意图：天然多肽经叠氮化修饰后，与具有点击化学修饰基团的DNA模板进行快速偶联并纯化获得OPO文库。（右）与现有纳米孔设备适配的高通量多肽传感体系示意图。

本工作所使用的纳米孔阵列芯片本身具备高通量数据产出能力，每小时可产出超10万条有效检测数据，为复杂的多肽传感信号解析奠定了基础。研究发现，源自同一种多肽的电流信号在呈现多样性的同时，亦展现出高度一致的电流趋势，这些信号的叠加图构成了一幅类似“密度矩阵”的指纹图谱，揭示了多肽通过纳米孔时的主要信号特征。

实验表明，这一图谱对多肽中氨基酸的电性、体积、极性等变化高度敏感，能够检测单氨基酸位点突变、位置异构以及磷酸化等翻译后修饰引起的细微改变。结合神经网络分类和密度矩阵过滤技术，研究团队成功实现了对多种天然多肽的准确区分，解决了纳米孔信号解析的关键难题。

（左上）以多肽Pep1为例，将2万张多肽传感信号叠加后，形成独特的信号趋势分布。（左下）通过算法模拟，将叠加信号的密度分布转化为可量化的密度矩阵。（右）自动化算法处理流程。

基于该技术对相似多肽的高区分度，研究团队进一步探索了其实际应用潜力。在抗体研究领域，团队发现OPO文库的检测数据产出比例与抗体亲和力呈正相关。利用这一量化关系，研究团队首次在纳米孔测序设备上实现了抗原线性表位的鉴定及抗体亲和力的半定量比较。

此外，在蛋白质鉴定领域，针对三种人源蛋白开展的单盲实验中，团队通过蛋白质酶切、文库制备及肽段识别，实现了蛋白质种类的准确判定，验证了这一端到端方案的可靠性，为拓展纳米孔测序仪的应用领域奠定了实验基础。

（上）将覆盖C肽全长的六条短肽制备成等比例混合OPO文库，并用不同的抗体进行富集，通过富集比例差异，验证了商业化抗体对应的真实表位信息。（下）利用Anti-FLAG抗体对不同的FLAG突变体进行富集并构建OPO文库，通过富集比例评估了不同突变体的亲和力强弱。

文章共同第一作者、华大生命科学研究院陈俊毅博士指出：“我们通过整合温和高效的OPO文库制备策略与自动化的数据分析流程，依托纳米孔高通量传感平台，攻克了纳米孔蛋白质分析中通量低、天然样品文库制备难、信号解析复杂等行业难题。该技术不仅实现了对肽段的高精度区分，还可拓展应用于抗体表位确定、亲和力半定量评估、天然蛋白质鉴定等场景，为蛋白质组学研究提供了可靠的技术路径。”

谈及技术的未来发展，本文通讯作者、华大集团首席研究员、基因组多维解析技术全国重点实验室主任徐讯表示：“未来，我们将继续聚焦多肽直接检测，从蛋白指纹图谱分析起步，逐步搭建高通量亲和力筛选平台，并将其推进至活性多肽发现领域；同时借助靶向富集策略，实现间接靶标检测，借助纳米孔设备的高灵敏度，将难以直接检测的生物分子转化为可读信号，从而将纳米孔检测平台打造成一个覆盖更广、灵敏度更高的多组学分析平台，为生命科学研究、生物医药研发等领域提供更强大的技术支撑。”

基因组多维解析技术全国重点实验室徐讯研究员、董宇亮研究员和华大集团刘斯奇研究员为本文共同通讯作者，王冀博士、陈俊毅博士、潘海林研究员、罗凤琴和秦文兵博士为该论文共同第一作者。该工作获得了科技部国家重点研发计划、深圳市科创委和浙江省科技厅省重点研发计划的资助，以及基因组多维解析技术全国重点实验室和武汉华大生命科学研究院的大力支持。

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