《食品科学》：新疆大学杨洁教授等：基于实时聚合酶链式反应检测特种乳中牛乳的掺伪

近年来，人们对特种乳及其乳制品的需求持续增加，刺激了特种乳制品的发展。特种乳由于产量远远低于牛乳，售价昂贵，在经济利益的驱动下，市场上频发低价乳掺入高价特种乳的现象，侵害了消费者的合法权益、

目前已有许多不同的策略被用于乳制品掺假的检测，基于DNA作为靶标的分析检测技术，可发展成为可信度较高的定性检测方法，包括常规聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR、实时PCR（PCR）、数字PCR（dPCR），其他与PCR相结合的技术等。其中real-time PCR方法是目前最重要的食品掺伪检测方法之一，主要分为基于染料的SYBR Green real-time PCR和基于探针的

Taq

新疆大学生命科学与技术学院的李威、孙国栋、杨洁*等人旨在建立一种以牛乳DNA为靶标的real-time PCR检测方法，通过设计特异性引物，并考察不同的特种乳及其乳制品中掺伪的牛乳DNA水平，以此对特种乳中掺假的牛乳进行定性、定量检测。同时，以驼乳以及驼乳制品为检验对象，利用所建立的方法对20 种随机购买的市售标有纯骆驼（

Camelus bactrianus

1 引物及探针特异性验证

1.1 SYBR Green real-time PCR引物特异性验证

采用SYBR Green real-time PCR，利用牛特异性引物（GHR）与通用引物（MSTN）分别与5 种样品乳（驼乳、马乳、羊乳、驴乳和牛乳）中提取出的DNA进行了扩增，同时建立无模板阴性对照。如图1A所示，与其他4 种乳源物种DNA相比，牛特异性引物只在牛乳DNA中进行了扩增，反应中没有发生任何交叉污染或扩增失败，扩增曲线的Ct值为19.191，3 次测试曲线高度重合，反应较为灵敏；而选择的通用引物分别在牛乳和其他特种乳基因组中均进行了扩增，反应中同样无交叉污染或扩增失败，牛乳、驼乳、驴乳、羊乳和马乳DNA扩增曲线的Ct值如图1B所示。以上结果表明，所选取的通用引物可以将本实验中5 种乳源物种的基因组进行扩增，而所设计的牛特异性引物具有高度的特异性，能够较好地区分牛与其他乳源物种，且不会对其他哺乳动物物种造成识别错误，实验的重现性良好。

1.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR，使用牛特异性引物探针（Cyt B）分别与驼乳、驴乳、马乳、羊乳和牛乳中提取的基因组DNA进行扩增，同时设置无模板阴性对照，结果如图2A所示，只扩增出牛乳中提取的DNA，扩增曲线的Ct值为19.205，与SYBR Green real-time PCR扩增曲线的Ct值（19.191）接近，并且在驼乳、驴乳、马乳、羊乳的基因组DNA和阴性对照组均未出现扩增曲线，说明该引物特异性同样良好。而使用真核通用引物探针（18S RNA）分别与5 种乳中提取的基因组DNA进行反应扩增，同时设置无模板阴性对照。类似地，通用引物在5 种乳中均进行了扩增，牛乳、羊乳、驴乳、马乳和驼乳的DNA扩增曲线的Ct值如图2B所示，采用TaqMan realtime PCR技术并使用牛特异性引物探针（Cyt B）同样具有高度的特异性，能够较好地区分牛与其他乳源物种。

2 方法灵敏性验证结果

2.1 SYBR Green real-time PCR方法灵敏性验证

如图3A所示，牛特异性引物（GHR）最低可检测到0.001 ng牛模板DNA，具有较高的灵敏度，以各稀释质量浓度DNA对应的Ct值建立DNA质量浓度标准曲线，得到牛乳DNA质量浓度标准曲线为y＝-3.629 5x+27.075，R2＝0.996 2，具有良好的线性度，定量范围1 pg～100 ng（图3B）。通用引物（MSTN）灵敏度结果如图3C所示，通用引物最低可检测到0.1 ng模板DNA。将所得各稀释质量浓度DNA对应的Ct值建立DNA质量浓度标准曲线，此时牛乳DNA质量浓度标准曲线为y＝-3.454 5x+30.21，R2＝0.997 2，具有良好的线性度，定量范围10 pg～100 ng（图3D）。已有研究报道，Guo Liang等以线粒体12S rRNA为生物标识物设计引物，牛乳DNA的检测灵敏度在原料乳中为0.001 ng，酸马乳中为0.005 ng。Hai Xiao等以线粒体12S rRNA为生物标识物设计牛源引物，灵敏度为0.1～50 pg。以上研究结果与本研究中检测灵敏度存在差异，表明采用相同的方法但设计或选择的引物不同同样对检测结果会造成重要影响；此外，提取DNA的质量、PCR的扩增效率以及是否采用了不同的处理方式，如热处理等均会直接影响方法的检测限及灵敏度；通常热处理对DNA质量有一定的影响，可能会造成PCR方法的灵敏性偏低。

2.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR验证方法的灵敏性良好，如图4A所示，牛特异性引物（Cyt B）可以扩增到0.01 ng基因组DNA，将所得各稀释质量浓度DNA对应的Ct值建立DNA质量浓度标准曲线，牛乳基因组DNA质量浓度标准曲线为y＝-4.862 8x+28.262，R2＝0.996 9，线性良好，定量范围为10 pg～100 ng，如图4B所示。利用通用引物（18S RNA）进行real-time PCR体系扩增，可以扩增到0.01 ng基因组DNA（图4C），将所得各稀释质量浓度DNA对应的Ct值建立DNA质量浓度标准曲线，DNA质量浓度标准曲线为y＝-3.044 9x+30.851，R2＝0.978 2，定量范围为10 pg～100 ng，如图4D所示。在本研究中，与TaqMan real-time PCR方法相比，SYBR Green real-time PCR方法的灵敏性略高，这是由方法本身的特点所决定的。染料SYBR Green I能够非特异性地结合DNA双链，受环境影响较小，而TaqMan real-time PCR的荧光激发是利用Taq酶切割探针而实现的，酶活力受环境温度、pH值等因素的影响较大，因此，TaqMan real-time PCR的灵敏性通常均会低于SYBR Green real-time PCR为正常现象，这与前人的报道保持一致。

3 方法检测限验证结果

3.1 SYBR Green real-time PCR方法检测限验证

采用SYBR Green real-time PCR方法对不同特种乳的各掺假样品DNA准确定量至100 ng后进行检测。驴乳掺假样品检测结果如图5所示，牛乳特异性real-time PCR体系在3 种处理方式的驴乳掺假样品（原料乳、巴氏杀菌乳、喷雾干燥乳粉）中的检测限均为0.1%，新鲜驴乳与经过加工处理的驴乳中牛乳的掺伪检出限相似，表明加工处理措施并未显著降低该方法的灵敏度，且日间测定的相对标准偏差（RSD）低于2%，即仪器的日间精密性良好，实验可重复性高。由于Ct值与DNA拷贝数呈负相关，因此Ct值与牛乳掺入量呈良好的线性响应。采用公式建立校准模型：其中新鲜驴乳中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-3.775 1x+29.671，R2＝0.995 1；巴氏杀菌驴乳中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-4.207 2x+32.206，R2＝0.996 2；驴乳粉中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-3.171 8x+32.019，R2＝0.996 8，线性均呈现良好。

驼乳掺假样品检测结果如图6所示，牛乳特异性real-time PCR体系在鲜驼乳、巴氏杀菌驼乳掺假样品中的检测限为0.1%，然而，与鲜驼乳与巴氏杀菌驼乳相比，喷雾干燥驼乳粉中牛乳掺入量的检测限略有升高，为1%，这表明乳粉制备过程中，喷雾干燥较高的温度条件对检测限产生了一定影响，导致检测限升高，灵敏度下降。采用公式建立校准模型：其中鲜驼乳中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-3.470 5x+31.119，R2＝0.997；巴氏杀菌驼乳中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-2.599 9x+33.087，R2＝0.993 9；驼乳粉中牛乳掺入量的拟合曲线为y＝-6.146x+37.332，R2＝0.994 3。

马乳掺假样品检测结果如图7所示，牛乳特异性realtime PCR体系在原料乳、巴氏杀菌乳掺假样品中的检测限均为0.1%，喷雾干燥乳粉的检测限为1%，且日间的各个测定的数据RSD低于2%。其中原料马乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.684 7x+30.367，R2＝0.998 1；巴氏杀菌马乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-4.907 6x+31.688，R2＝0.993 7；马乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.927 5x+32.864，R2＝0.995 6。

羊乳掺假样品检测结果如图8所示，羊乳特异性realtime PCR体系在3 种处理方式的掺假样品中的检测限均为0.1%，且日间的各个测定数据RSD低于2%。其中原料羊乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.227 7x+31.686，R2＝0.992 3；巴氏杀菌羊乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-2.442 4x+31.44，R2＝0.995 7；羊乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-2.788 2x+27.16，R2＝0.990 1。

3.2

Taq

采用TaqMan real-time PCR方法对不同特种乳的各掺假样品DNA准确定量至100 ng后进行检测。驴乳掺假样品检测结果如图9所示。牛乳特异性real-time PCR体系在原料乳、巴氏杀菌乳、喷雾干燥乳粉掺假样品中的检测限均为0.1%，日间RSD低于2%，同样表明方法的日间精密性良好，实验可重复性高。其中新鲜驴乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-4.228x+28.915，R2＝0.994 1；巴氏杀菌驴乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-4.899 4x+31.992，R2＝0.991 5；驴乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-2.095 8x+29.089，R2＝0.990 5。

驼乳掺假样品检测结果如图10所示，牛乳特异性real-time PCR体系在原料乳、巴氏杀菌乳掺假样品中的检测限与SYBR Green real-time PCR方法保持一致，也为0.1%，同样观察到喷雾干燥乳粉的检测限略有升高，为1%，日间RSD低于2%。这表明，对于采用不同的检测方法，实际样品本身的性质以及受热处理的程度是重要的内因，会直接影响样品检测限的变化。此时，鲜驼乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-4.320 4x+29.698，R2＝0.997 5；巴氏杀菌驼乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-6.009 7x+34.998，R2＝0.998 4；驼乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-7.844 2x+36.26，R2＝0.999 5。

马乳掺假样品检测结果如图11所示，牛乳特异性real-time PCR体系在原料乳、巴氏杀菌乳粉掺假样品中的检测限为0.1%，喷雾干燥乳粉的检测限为1%，且日间的各个测定的数据RSD低于2%。其中原料马乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-2.827x+28.632，R2＝0.997 2；巴氏杀菌马乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-4.359 4x+29.628，R2＝0.991 6；马乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.326 3x+31.533，R2＝0.995 6。

羊乳掺假样品检测结果如图12所示，羊乳特异性real-time PCR体系在原料乳中的检测限为0.1%，在巴氏杀菌乳、喷雾干燥乳粉掺假样品中的检测限均为1%。且日间测定的数据RSD低于2%。其中新鲜羊乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.649x+27.733，R2＝0.992 4；巴氏杀菌羊乳中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-3.047 5x+28.767，R2＝0.991 1；羊乳粉中牛乳掺入量拟合曲线为y＝-5.413 9x+33.57，R2＝0.990 0。

4 方法评价

根据本研究中的检测限，分别选取牛乳掺假比例5%、25%和50%进行重复实验，对数据的重现性、牛乳的预测掺假含量、回收率进行评估，结果如表2所示，SYBR Green方法中牛乳掺假比例为5%、25%和50%样品对应Ct值日间精密性的RSD均低于2%，表明稳定性强，驼乳、马乳、驴乳和羊乳的5%、25%和50%掺伪比例实际测量的平均值分别为8.01%、25.07%和53.03%，总平均回收率为122%，但在对实际掺假比例为5%的样本进行检测时，回收率达到了160%，说明SYBR Green的检测方法在掺假比例较低时，准确率偏低，检测结果偏高，同时在实际掺假比例为50%时，回收率为106%，略大于105%，所以在掺假比例较高时，SYBR Green检测方法的检测结果也略高，整体来看，该方法的检测结果要高于TaqMan方法。类似地，TaqMan方法的5%、25%和50%对应Ct值日间精密性的RSD同样低于2%，驼乳、马乳、驴乳和羊乳5%、25%和50%的测量平均值为4.79%、23.54%和52.37%，总平均回收率为98.23%，稳定性较强。

5 市售乳粉检测

以驼乳为掺伪乳源，随机购买了20 种商品标识为纯特种乳粉的市售样本，按照对应的牛乳掺入量标准曲线进行检测，各一式3 份平行测定，通过计算获得商业纯乳粉样本中牛乳粉的含量，检测结果如表3所示。在20 种标为全脂纯乳粉的商业乳粉样本中，有8 种乳粉中检测到了牛源性成分，其中7 种乳粉的掺假比例超过了5%，表明这7 种乳粉中掺入了牛乳，这7 种驼乳粉为PCP1-1、PCP1-3、PCP1-5、PCP1-12、PCP1-15、PCP1-17、PCP1-20，为蓄意掺假乳粉，该方法的检测结果与本实验室以前建立的超高液相方法的检测结果一致，这排除了检测结果的假阳性和假阴性情况。结果表明，该方法可实际应用于商业乳粉中掺假牛乳的筛查和检测。

结论

本研究基于SYBR Green和TaqMan real-time PCR技术，以DNA为掺假标志物，分别设计了基于两种方法不同的特异性引物，并分别建立了定性定量检测特种乳及其不同的热加工产品中掺假牛乳的方法。DNA含量测定结果和Ct值之间呈现出良好的线性关系。通过考察热加工处理对掺假标志物的影响，验证了两种方法均具有可靠性，能够准确鉴别牛乳与特种乳成分，最低能检测到1 pg牛乳DNA，定量范围为1 pg～100 ng。方法的检测限低至0.1%，检测限范围为0.1%～100%，可应用于特种乳产品中新鲜乳、巴氏杀菌乳、乳粉中掺假牛乳的检测。通过20 种标为全脂纯乳粉的商业乳粉样本的检测，验证其中7 个样本被发现蓄意掺假牛乳。本研究开发的real-time PCR方法可作为一种快速、有效的检测方法用于商业乳制品中牛乳掺伪的定性及定量分析，表现出高灵敏性和特异性，具有重要的理论参考和实际应用价值。

引文格式：

李威, 孙国栋, 鹿嘉榕, 等. 基于实时聚合酶链式反应检测特种乳中牛乳的掺伪[J]. 食品科学, 2025, 46(6): 263-274. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240727-273.

LI Wei, SUN Guodong, LU Jiarong, et al. Detection of bovine milk adulteration in non-novine milk using real-time polymerase chain reaction[J]. Food Science, 2025, 46(6): 263-274. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240727-273.

实习编辑：安宏琳；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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